多元素分析結合化學計量學方法快速判別寧夏和青海枸杞

連思雨,謝瑜杰,張紫娟,范春林,王明林，陳輝*

1(中國檢驗檢疫科學研究院，北京,100176) 2(山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安,271018)

隨著人們生活質量提升，枸杞等藥食兼用的特色高值農產品開始進入大眾視野。枸杞中含有豐富的多糖、氨基酸、黃酮類化合物、甜菜堿、維生素和微量元素等營養成分[1-2]，具有提高機體免疫力、改善視力、調節血糖、血脂、血壓、延緩衰老、抗癌抑制腫瘤等效用[3-5]，已經成為生活中常用的養生滋補佳品。但隨著科研深入，人們已經不滿足單純對枸杞的營養成分、藥理作用[6]進行研究，更傾向于枸杞產地、來源等真實性信息探究，這也是消費者直接關心的問題。

目前常用的食品產地溯源的方法有穩定性同位素技術、近紅外光譜技術及礦物元素分析技術等。穩定性同位素技術在谷物溯源時使用較多，CHUNG等[7]和RASHMI等[8]曾應用穩定性同位素技術分別對來自不同地域的水稻以及小麥進行溯源。近紅外光譜技術在魚類和肉類中應用廣泛[9]，OTTAVIAN等[10]利用近紅外光譜技術對野生和飼養的海鱸魚進行區分；孫淑敏[11]和史巖等[12]利用近紅外光譜技術對肉類進行溯源。礦物元素溯源技術較為常用，在肉類[13]、魚類[14]、酒類[15]及谷物類[16]均有應用。比較國內外溯源技術發現，礦物元素分析技術通過元素差異鑒別食品產地，操作簡單且更加快速準確，是食品產地溯源的關鍵[17-18]。

枸杞原本為野生資源，從20世紀60年代開始廣泛種植，如今枸杞在我國主要有寧夏、青海、甘肅、內蒙及新疆等幾大產區。目前寧夏枸杞、中寧枸杞已經注冊為地理標識，價格昂貴[19]但深受大眾喜愛；青海地區由于其地理位置優越，污染較少，已經發展為我國枸杞的第2大產區，種植面積達到了43.9萬畝，成為后起之秀[20]，但在價格和影響力方面仍不及寧夏枸杞。由于兩大產區的枸杞相似性很高，不法商販為了謀取利益，經常利用消費者心理虛構產地，導致枸杞市場混亂。因此，關于寧夏和青海兩大產區的枸杞鑒別技術亟待發展。

本文應用電感耦合等離子體-質譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)測定了寧夏地區和青海地區共180種枸杞中44種元素含量，首次通過測定元素含量結合化學計量學方法，包括偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)和反向傳輸人工神經網絡(back propogation artificial neural network, BP-ANN)，建立了寧夏和青海枸杞產地的溯源模型，并考察模型的特異性和靈敏度，為枸杞溯源及產地鑒別提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器于設備

超微量天平,梅特勒-托列多儀器上海有限公司；Milli-Q超純水系統,美國Millproe公司；Agilent 7700x電感耦合等離子-質譜儀,美國Agilent Technologies；CEM MARS 6 微波消解儀,美國CEM公司。

1.2 試劑和材料

濃HNO3、H2O2，均為MOS級，北京化學試劑廠；超純水(18.2 MΩ·cm)：由Milli-Q超純水系統所制，用于定容樣品溶液和配制標準溶液；稀土元素標準儲備液(10 μg/mL)、多元素標準儲備液(10 μg/mL)、內標液(100 μg/mL)、調諧液(10 μg/L), 美國Agilent Technologies；Rh單元素標準溶液(1 000 μg/mL), 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；國家標準物質胡蘿卜(GSBW10047)。

2018年在寧夏玉門、瓜州、惠農等地區收集地理信息可靠的枸杞樣品99個，在青海都蘭縣、諾木紅等地區收集地理信息可靠的枸杞樣品81個。

1.3 溶液配制及樣品前處理

標液制備：將稀土元素標準儲備液和多元素標準儲備液逐級稀釋至適當濃度；內標液：將100 μg/mL的標準液用10% HNO3(體積分數)稀釋成1 mg/L，Rh標準液用于稀土元素分析；調諧液：將10 μg/L調諧液用10% HNO3稀釋成1 μg/L。

取適量枸杞放入烘箱，在65 ℃條件下烘烤48 h，冷卻后研磨至粉末狀態，過60目篩，裝入100 mL樣品瓶貼簽備用。

用超微量天平稱取0.2 g粉末狀樣品，精確至0.000 1 g，放入潔凈干燥的聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL濃HNO3，室溫下放置過夜，次日加入2 mL H2O2，室溫下反應20 min，將聚四氟乙烯消解罐加蓋后放入微波消解儀按照表1設定好的程序進行消解。

表1 微波消解工作參數

消解完成后，冷卻至室溫后打開消解罐，用超純水洗滌消解罐3次，定容至50 mL，混勻。

1.4 ICP-MS測定條件

ICP-MS測定的參數均由儀器自動調諧給出，每次測定前均進行調諧，根據儀器的狀態對參數進行調整，以滿足靈敏度、氧化物、穩定性等各項指標。射頻功率1 550 W，射頻電壓1.66 V，載氣流量1.00 L/min，蠕動泵采集樣品時轉速0.1 r/s。

1.5 數據處理

在與測定實驗樣品相同的儀器條件下連續測定試劑空白6次，以試劑空白檢出限的3倍為定量限(limit of quantitation, LOQ)濃度，10倍為檢出限(limit of detection, LOD)濃度。應用安捷倫Mass hunter軟件進行數據處理，所有元素含量統一濃度后(μg/kg)直接導入Mass Profiler Professional軟件應用單邊方差分析(P<0.05)，并應用該軟進行PLS-DA和BP-ANN分析。

2 結果與討論

2.1 元素含量分析

對寧夏和青海2個地區枸杞的稀土元素和礦物元素含量進行統計，結果見表2，枸杞中元素含量存在明顯差異。從表2可以看出，在稀土元素中，除寧夏地區La的平均含量>1 mg/kg，兩地其余稀土元素含量均處于較低水平，寧夏地區枸杞樣品稀土元素的平均含量均高于青海地區；微量元素測定結果顯示，兩地區K、Na、Mg 3種元素含量較高，寧夏地區其平均含量分別為15 697、5 867、1 057 mg/kg，青海地區平均含量分別為15 361、3 969、809 mg/kg；其次是寧夏地區Al、Ca、Fe、Sb、Zn、Mn、Cu、Sr、Cr、Rb、Ba 11種元素和青海地區Al、Ca、Fe、Sb、Zn、Mn、Cu、Sr、Rb 9種元素，這些元素的平均含量均高于1 mg/kg；兩地其余元素均處于較低水平，對比發現，Sb在寧夏地區枸杞中含量僅為27.963 mg/kg，而青海地區高達71 094 mg/kg，是青海地區唯一高于寧夏地區的元素。

表2 寧夏和青海地區枸杞元素含量 單位：mg/kg

將兩地枸杞樣品平均值進行統計分析，所測44種元素中Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se 9種元素存在顯著性差異(P<0.05)。這些結果可能與枸杞生長的地理環境、氣候條件息息相關。

2.2 模型的靈敏度和特異性

對于只含有2類樣品判別的模型，可以采用靈敏度和特異性這2個參數對其進行評價。靈敏度是指在模型中某類樣品被識別為該類樣品的百分比，特異性是指其他類樣品不被判別為該類樣品的百分比。對于該類模型，存在4種情況，即真陽性(true positive, TP)，真陰性(true negative, TN)，假陽性(false positive, FP)和假陰性(false negative, FN)，用TP/(TP+FN)×100來表示模型靈敏度，用TN/(TN+FP)×100來表示模型特異性[21]。

2.3 主成分分析

所有枸杞樣品中的元素含量統一為質量分數后(μg/kg)直接導入軟件，Mass Profiler Professional (MPP，version B. 15.0)進行分析。應用MPP對寧夏和青海枸杞中44種元素含量進行統計分析，以寧夏枸杞樣品為中心，按照不同樣品間元素含量倍數2倍對元素進行過濾，將具有顯著差異的9種元素(Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)。圖1給出了99個寧夏枸杞和81個青海枸杞樣品在前2個主成分的得分分布圖，除個別樣品外，青海和寧夏枸杞樣品基本可以分開。寧夏枸杞位于第1主成分的負半軸，青海枸杞位于第1主成分的正半軸，前2個主成分可以解釋64.2%的變量，這表明，寧夏和青海枸杞中元素含量存在著一定的差異，基于多種元素對寧夏和青海枸杞進行判別是可行的。

寧夏(■);青海(▲)

2.4 模型建立與預測

2.4.1 PLS-DA模型

基于前述9種元素，應用PLS-DA算法建立青海和寧夏枸杞的判別模型，采用多重交叉檢驗的方式進行模型驗證，重復10次。在模型確認和模型訓練中寧夏枸杞樣品判別的靈敏度均為100%，而青海枸杞則均有2個樣品被判別為寧夏枸杞，模型的特異性為97.5%。為了進一步驗證模型的可靠性，分別從青海和寧夏枸杞中隨機選出75%的樣品建立模型，剩余25%的樣品則用于對模型進行確認。結果表明，應用75%的枸杞樣品建模時，74個寧夏枸杞和61個青海枸杞均分別有1個樣品被誤判，模型的識別靈敏度和特異性分別為98.6%和98.4%，見表3。應用該模型對剩余25%的枸杞樣品進行判別，25個寧夏枸杞和20個青海枸杞均能被準確預測，模型預測的準確率為100%。

表3 PLS-DA和BP-ANN模型靈敏度和特異性比較 單位：%

2.4.2 BP-ANN模型

基于前述9種元素，應用BP-ANN算法建立青海和寧夏枸杞的判別模型，采用分層人工神經網絡模型，輸入層含有7個神經元，隱層含有3層,每層含15個隱含節點，輸出層為2個節點；迭代層數為100；驗證類型為留一法。在模型確認和模型訓練中青海和寧夏枸杞樣品判別的靈敏度和特異性均為100%，即在該模型中青海和寧夏枸杞均能完全區分。

與PLS-DA模型類似，采用75%的樣品建模，25%的樣品預測的方式對BP-ANN方法建立的青海和寧夏枸杞判別模型的可靠性進行驗證。結果表明，應用75%的枸杞樣品建模時，74個寧夏枸杞和61個青海枸杞均能準確分類，模型的靈敏度和特異性均為100%，應用該模型對剩余25%的枸杞樣品進行判別，25個寧夏枸杞和20個青海枸杞均能被準確預測，模型預測的準確率為100%，見表3。

這表明，相比于PLS-DA模型，基于多種微量元素建立的寧夏和青海枸杞BP-ANN模型具有較強的判別能力。

3 結論

本文應用微波消解結合ICP-MS測定了來自寧夏和青海共180個枸杞樣品中44種微量元素含量。結果顯示，2個地區枸杞中Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se 9種微量元素存在顯著差異，對9種差異性成分進行PCA分析識別，前2個主成分可以解釋64.2%的變量，基本可以區分寧夏和青海2個地區的枸杞樣品。利用PLS-DA算法和BP-ANN算法建模，發現BP-ANN模型的靈敏度和特異性均為100%，優于PLS-DA模型。總而言之，本文首次建立的基于多元素分析、結合模式識別快速判別寧夏和青海枸杞的溯源技術，可以快速實現兩地枸杞的判別。