液態(tài)與固態(tài)酵素理化成分及抗氧化活性的研究

余思潔，OH YOUNG JOO ，李洪軍，KIM TAE SUK ，賀稚非*，LEE SANG YUN ，李少博，李敏涵

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(韓國圃美多有限責(zé)任公司，韓國，120-749)

酵素是由日語中的“酶”翻譯而來的，是日本對酶的別稱[1]，狹義上的酵素是指酶，現(xiàn)在市面上的酵素是廣義上的酵素，是包含酶和其他生物活性物質(zhì)的混合物。我國《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》將食用酵素定義為：以動物、植物、菌類為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可食用的酵素產(chǎn)品[2]。植物酵素是其中常見的一類，通常采用一種或多種果蔬、谷物以及中草藥等植物作為原料，經(jīng)有益菌發(fā)酵后，形成富含酚類、黃酮類、花青素[3-4]等生物活性物質(zhì)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、蛋白酶等功能酶的可食用發(fā)酵型液態(tài)或固態(tài)食品。具有抗氧化[5]、調(diào)節(jié)免疫[6]、潤腸通便[7]等功能，備受消費(fèi)者青睞。

目前市面上銷售的酵素產(chǎn)品主要可以分為液態(tài)酵素和固態(tài)酵素。液態(tài)酵素是經(jīng)過發(fā)酵、滅菌、包裝等必要的處理后在常溫下是液態(tài)的酵素產(chǎn)品，固態(tài)酵素是將發(fā)酵后得到的液態(tài)酵素進(jìn)行噴霧干燥或真空冷凍干燥等技術(shù)制得的形態(tài)為粉末、顆粒、片狀或塊狀的酵素產(chǎn)品[2,8]。固態(tài)酵素的出現(xiàn)豐富了產(chǎn)品形態(tài)，且具有便于運(yùn)輸、貯藏、使用等特點(diǎn)[9]，但是在干燥過程中可能會對酵素中的理化成分或生物活性物質(zhì)造成破壞，從而影響到酵素的功能酶活力和抗氧化活性等。

國內(nèi)在制備食用酵素方面的研究迅速發(fā)展，逐漸開發(fā)出各種新型酵素產(chǎn)品，但市場上的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，科學(xué)研究主要集中在開發(fā)不同原料酵素的制作工藝方面[10]，對市售液態(tài)酵素和固態(tài)酵素2種不同形態(tài)產(chǎn)品的質(zhì)量及功能性的對比研究鮮有報(bào)道。為了分析與比較市售不同形態(tài)酵素產(chǎn)品的差異，選取市面上常見的3種液態(tài)酵素和3種固態(tài)酵素，測定其理化成分、生物活性物質(zhì)以及抗氧化活性，并分析差異，為酵素產(chǎn)品的開發(fā)和市場推廣提供理論依據(jù)，促進(jìn)酵素行業(yè)的多元化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)選取6種市售酵素產(chǎn)品(3種液態(tài)酵素，3種固態(tài)酵素)，均購置于各品牌酵素專賣店，為正規(guī)的工業(yè)化生產(chǎn)酵素產(chǎn)品，詳細(xì)信息見表1。

表1 市售酵素樣品信息

NaOH、HCl、CuSO4、乙醚、石油醚、乙醇、乙酸鈉、橄欖油，重慶市鈦新化工有限公司；乙酸鋅、鐵氰化鉀、Al(NO3)3、Na2CO3、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，重慶躍翔化工有限公司；酚酞、NaNO2、冰乙酸，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；亞鐵氰化鉀、聚乙烯醇、福林酚,上海源葉生物科技有限公司；KCl、酪蛋白，北京酷來搏科技有限公司；酒石酸鉀鈉、FeCl3、三氯乙酸，成都西亞化工股份有限公司；SOD活性檢測試劑盒、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；L-酪氨酸，成都瑞芬思生物科技有限公司；DPPH，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；BSA323S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；5430R低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；PAL-1手持式折光儀，廣東市愛宕科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

消費(fèi)者在攝入液態(tài)酵素時(shí)是直接飲用，而攝入固態(tài)酵素產(chǎn)品時(shí)需要加入水將固態(tài)酵素變?yōu)橐簯B(tài)，為保證2類產(chǎn)品的可比性，試驗(yàn)前先對固態(tài)酵素進(jìn)行預(yù)處理，根據(jù)產(chǎn)品說明中的食用方法，分別取樣品5 g，純水定容至100 mL，作為試驗(yàn)樣品備用。

1.3.2 液態(tài)酵素與固態(tài)酵素感官評價(jià)

參考食用植物酵素[11]感官要求及邢慧雅[12]的方法，結(jié)合酵素產(chǎn)品的感官特點(diǎn)，對酵素進(jìn)行感官評價(jià)，取處理后的酵素樣品各100 mL，由10位接受過感官評價(jià)培訓(xùn)的專業(yè)人員(5男5女)根據(jù)感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 酵素產(chǎn)品感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 液態(tài)酵素與固態(tài)酵素理化成分的測定

pH值測定：參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》使用pH計(jì)進(jìn)行測定。

總酸含量(以蘋果酸計(jì))測定：按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進(jìn)行測定。

還原糖含量(以葡萄糖計(jì))測定：按照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》中的直接滴定法進(jìn)行測定。

可溶性固形物測定：手持式折光儀。

1.3.4 總酚含量的測定

參考ADOM等[13]的方法，采用福林酚法測定，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.021 3x+0.036 8(R2=0.994 9)。

1.3.5 總黃酮含量的測定

參考LIU等[14]的方法，采用Al(NO3)3顯色法測定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.013x-0.034(R2=0.996 6)。

1.3.6 花青素含量的測定

參考LEE等[15]的方法，采用pH示差法測定。

1.3.7 功能酶活力的測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)酶活力的測定：采用SOD活性檢測試劑盒測定。

脂肪酶活力的測定：參考GB/T 23535—2009,使用滴定法進(jìn)行測定。

蛋白酶活力的測定：參考GB/T 23527—2009,使用福林法進(jìn)行測定，以L-酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.01x+0.003 4(R2=0.999 9)。

α-淀粉酶活力的測定：參考GB/T 24401—2009進(jìn)行測定。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測定

參考ALVAREZ等[16]的方法，將試驗(yàn)樣品進(jìn)行稀釋，配制成1、2.5、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1 000 μL/mL的待測液，在1 mL待測液中加入0.2 mmol/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)乙醇溶液3 mL，混勻避光30 min，測定517 nm處吸光度，按公式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：Ai, 樣品+乙醇的吸光度；Aj, 純水+DPPH乙醇溶液的吸光度；A0，樣品+ DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.3.9 總還原力的測定

參考SUN等[17]的方法略作修改。將試驗(yàn)樣品進(jìn)行稀釋，配制成5、10、20、50、100、200、500、1 000 μL/mL的待測液，在1 mL待測液中加入pH 6.6的磷酸緩沖液2.5 mL及10 g/L的鐵氰化鉀溶液5 mL，混勻后在50 ℃水浴20 min，再加入100 g/L的三氯乙酸溶液5 mL混勻，離心后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水及1 g/L的FeCl3溶液0.5 mL，混勻，在700 nm處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，采用Origin 8.1軟件繪制圖表，采用SPSS 21.0、 Excel 2007等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵素產(chǎn)品感官評價(jià)

感官評定結(jié)果如圖1所示。Y1和G2在5個方面的評分均較高，得分均在8～9分之間，產(chǎn)品無沉淀，顏色鮮亮，酸甜適口，香味醇正，總體的風(fēng)味和諧。Y3、G1、G3的香味和風(fēng)味得分比較高，均在7分以上，但由于有少量的沉淀或懸浮物，導(dǎo)致口感不夠順滑，色澤不夠鮮亮，影響了感官評分。Y2在組織狀態(tài)、色澤、口感3個方面的得分比較高，但由于滋味不協(xié)調(diào)，有澀味影響了感官評分。總體來說，酵素產(chǎn)品的原始狀態(tài)對不同酵素產(chǎn)品的感官評價(jià)評分影響不大，主要取決于具體產(chǎn)品。

圖1 液態(tài)酵素與固態(tài)酵素感官評價(jià)雷達(dá)圖

2.2 不同酵素產(chǎn)品理化成分測定結(jié)果

由表3可知，6種酵素產(chǎn)品的pH都較低，可能是發(fā)酵過程中有機(jī)酸濃度增加所致[18]，液態(tài)酵素的總酸含量均高于固態(tài)酵素，這可能是由于固態(tài)酵素在干燥過程中成分損失造成的。在發(fā)酵過程中，糖類物質(zhì)作為碳源和能源物質(zhì)，會被微生物分解，導(dǎo)致還原糖和可溶性固形物含量較低[19]， Y1、Y2的還原糖含量、可溶性固形物含量較高且顯著高于其他酵素，可能是原料不同或在生產(chǎn)過程中為防止產(chǎn)品酸味過重，酸甜度不協(xié)調(diào)，添加了糖類物質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)品滋味造成的[20]。

表3 不同酵素產(chǎn)品的理化指標(biāo)

2.3 不同酵素產(chǎn)品活性成分測定結(jié)果

2.3.1 總酚含量

從圖2可知，不同酵素產(chǎn)品的總酚含量有顯著差異(P<0.05)，液態(tài)酵素的總酚含量均顯著高于固態(tài)酵素，其中Y2的總酚含量最高，為1 656.22 μg/mL，G1的含量最低，為7.78 μg/mL，在固態(tài)酵素中，G3的總酚含量最高，為175.76 μg/mL，Y2的總酚含量是G3總酚含量的9.4倍，說明固態(tài)酵素在干燥過程中可能導(dǎo)致酚類物質(zhì)破壞，與馮彥君[21]的研究結(jié)果一致。原料種類對同一狀態(tài)的酵素產(chǎn)品總酚含量有較大影響，但原料種類的多少與總酚含量的高低關(guān)系不大，猜測可能與原料本身總酚含量[22]或發(fā)酵菌種的選取[23]有關(guān)，固態(tài)酵素總酚含量差異可能還與干燥工藝的選取有關(guān)[24]。

圖2 不同酵素產(chǎn)品的總酚含量

2.3.2 總黃酮含量

由圖3可知，不同配方的酵素產(chǎn)品的總黃酮含量有顯著差異(P<0.05)，含量高低依次為：Y1>Y3>Y2>G2>G1>G3，液態(tài)酵素總黃酮含量高于固態(tài)酵素，其中Y1的總黃酮含量最高，為124.56 μg/mL，G3的含量最低，為1.91 μg/mL，G2是固態(tài)酵素中總黃酮含量最高的，為21.48 μg/mL，Y1的總黃酮含量是G2的5.8倍，目前在植物類粉末產(chǎn)品生產(chǎn)上常用的干燥方式有噴霧干燥、熱風(fēng)干燥及真空冷凍干燥等[25]，而黃酮類物質(zhì)對溫度比較敏感，可能是在干燥過程中受溫度的影響，發(fā)生酚類氧化反應(yīng)，造成了總黃酮含量下降[26]。

圖3 不同酵素產(chǎn)品的總黃酮含量

2.3.3 花青素含量

從圖4可知，不同配方酵素產(chǎn)品的花青素含量有顯著差異(P<0.05)，液態(tài)酵素的花青素含量顯著高于固態(tài)酵素，Y3的花青素含量最高，為22.49 mg/L，G2的花青素含量最低，為0.22 mg/L，G1是固態(tài)酵素中花青素含量最高的，為2.38 mg/L，Y3的花青素含量是G1的9.5倍。固態(tài)酵素中的花青素含量顯著低于液態(tài)酵素，可能是由于花青素具有熱不穩(wěn)定性，在干燥過程中極易被破壞[27]。

圖4 不同酵素產(chǎn)品的花青素含量

2.3.4 功能酶活力

6種市售酵素的功能酶活力測定結(jié)果見表4，可以看出不同酵素產(chǎn)品的同一種功能酶活力不同，6種酵素的SOD酶活力均較高，但差異很大，在193.23～1 214.46 U/mL之間，固態(tài)酵素的SOD酶活力顯著低于液態(tài)酵素，說明可能與各種酵素的后處理方式有關(guān)。與SOD酶活力相比，市售酵素的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶活力較低，可能是由于大部分果蔬的脂肪和蛋白質(zhì)含量低使得微生物在代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的量少，液態(tài)酵素的蛋白酶、脂肪酶活力顯著高于固態(tài)酵素，可能是固態(tài)酵素的干燥過程造成了損失[28]。3種液態(tài)酵素幾乎無α-淀粉酶活力，固態(tài)酵素α-淀粉酶活力較低，這可能是與發(fā)酵原料、菌種以及環(huán)境條件有關(guān)。

表4 不同酵素產(chǎn)品的功能酶活力分析

2.4 不同酵素產(chǎn)品對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

如圖5所示，6種酵素產(chǎn)品中的DPPH自由基清除能力由大到小依次為：Y2>Y1>Y3>G2>G3>G1，液態(tài)酵素的DPPH自由基清除能力顯著高于固態(tài)酵素，經(jīng)計(jì)算，Y2具有最高的DPPH自由基清除能力，其IC50為5.65 μL/mL，而最低的固態(tài)酵素G1在最大濃度時(shí)的DPPH自由基清除率僅有47.46%，無法計(jì)算其IC50值，除G1外的其余5種市售酵素的IC50值均在5.65～52.23 μL/mL。CHU等[29]研究表明，發(fā)酵物質(zhì)對自由基清除率表現(xiàn)出差異可能是原料、微生物菌種和發(fā)酵液代謝產(chǎn)物等的不同造成的。

a-樣品體積分?jǐn)?shù)0～1 000 μL/mL;b-樣品體積分?jǐn)?shù)0～200 μL/mL

2.5 不同酵素產(chǎn)品總還原力的測定結(jié)果

還原力的大小通常與還原劑的多少有關(guān)，還原劑能夠破壞自由基鏈，給出氫原子，發(fā)揮抗氧化作用，因此，還原力可以作為評價(jià)酵素的抗氧化活性的重要指標(biāo),測定結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同酵素產(chǎn)品的總還原力

2.6 不同酵素產(chǎn)品主要成分及抗氧化能力的相關(guān)性分析

由表5可知，DPPH自由基清除能力與脂肪酶活力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與還原糖、總酚、SOD酶、蛋白酶活力均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明不同配方的酵素產(chǎn)品中的總還原力由大到小依次為：Y2>Y1>Y3>G2>G3>G1，液態(tài)酵素的總還原力顯著高于固態(tài)酵素。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

DPPH自由基清除主要受還原糖、總酚、SOD酶、蛋白酶、脂肪酶活力的影響。總還原力與可溶性固形物、總酚、SOD酶、蛋白酶、脂肪酶活力均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與還原糖呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明總還原力主要受可溶性固形物、總酚、SOD酶、蛋白酶、脂肪酶活力的影響，這些物質(zhì)的作用取決于其具體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[30]。

3 結(jié)論

對液態(tài)酵素和固態(tài)酵素進(jìn)行了對比分析，酵素產(chǎn)品整體都含有較高的活性物質(zhì)和具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但是不同酵素產(chǎn)品的活性物質(zhì)含量有顯著性差異，這可能與原料、菌種以及環(huán)境條件有密切關(guān)系。液態(tài)酵素的抗氧化能力相對較強(qiáng)，同時(shí)根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，主要是由于液態(tài)酵素中還原糖、總酚、SOD酶、蛋白酶含量相對較高。液態(tài)酵素質(zhì)量優(yōu)于固態(tài)酵素，可能是固態(tài)酵素的干燥工藝導(dǎo)致功能活性物質(zhì)被破壞，從而影響固態(tài)酵素產(chǎn)品的品質(zhì)。不同產(chǎn)品間的各類物質(zhì)含量及抗氧化能力差異較大，總體趨勢是液態(tài)酵素主要成分含量較高，功能酶活性較強(qiáng)，抗氧化能力較強(qiáng)。為促使人們正確看待酵素產(chǎn)品，了解產(chǎn)品品質(zhì)提供了參考，對于促進(jìn)酵素行業(yè)健康發(fā)展具有指導(dǎo)意義。