重組大腸桿菌的高密度培養及在丙谷二肽生產中的應用

裴緒澤，李益民，杜聰，袁文杰

(大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連，116024)

谷氨酰胺因其在人體血漿和肌肉中含量都較高，并且在人體的生理生化過程中起到重要的作用，一直是一種重要的氨基酸產品。但谷氨酰胺在使用、保存等方面存在著種種問題，因此需要尋找替代品來發揮它的功效。二肽是最簡單的含酰胺鍵的組分，存在許多特殊而有趣的生物學活性[1]。丙谷二肽作為重要的二肽之一，具有溶解性好，熱穩定性高以及進入人體可以快速降解成谷氨酰胺等優點[2-4]，在許多功能性食品、保健品和藥品中被廣泛使用[5-7]。丙谷二肽的生產主要有化學合成與生物酶法2種[8]。人們對化學合成丙谷二肽研究較早，有氨基保護法、羧基內酸酐法等[9-10],但存在著生產步驟較多，有毒害物質參與生產過程等缺點。采用生物酶法生產丙谷二肽，具有生產過程中無毒無害，反應速率較快，專一性較強，副產物少等優點，被廣泛研究[11-12]。2005年，YOKOZEKI 等[13]首先發現了一種可以用作生產二肽的L-氨基酸連接酶。但α-酯酰基轉移酶比L-氨基酸連接酶具有更好的底物選擇性和更快的生產丙谷二肽速率[14]。本實驗前期通過采用氨基酸突變與密碼子優化等策略分別實現了α-酯酰基轉移酶在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達，完成了丙谷二肽的高效合成[15-16]。

高密度發酵策略是一種可以顯著提高微生物產率的方法，被廣泛應用到原核微生物、真核微生物以及藻類發酵過程的優化中[17-19]。在微生物高密度發酵過程優化中，影響因素主要有培養基構成、補料方式、溶氧、pH、代謝產物、外源蛋白的誘導方式等[20]。

為進一步降低培養過程成本，本文以實驗室構建的表達α-酯酰基轉移酶的重組大腸桿菌為出發菌株[15]，研究其高密度培養策略。實現了該菌株的高密度發酵，并且在高密度培養下的重組菌株表達的酯酰基轉移酶具有較好的活性，為采用生物法制備丙谷二肽的產業化奠定了基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

本實驗中，發酵使用試劑均為分析純或以上水平，實驗所用的液相色譜相關試劑均為色譜純級別。高密度發酵過程中使用的葡萄糖為工業純。O2，純度99%。

實驗菌株為本實驗室構建的E.coliBL21-pET29a-SsAET菌株。

分析儀器主要包括S6000高效液相色譜儀，華譜公司；Muitigo酶標儀，Thermo公司；Bio-3L發酵罐，上海百侖公司。

1.2 實驗流程

本實驗流程如圖1所示。以生物量和丙谷二肽產率作為優化主要參考因素，通過搖瓶條件和發酵罐條件對菌株培養方法進行選擇，最終確定該菌株高密度、高酶活力的發酵方式。

圖1 實驗流程圖

1.3 培養基成分優化

重組菌株在活化之后，以1%體積分數的接種量接入到含有50 μg/mL卡那霉素的培養基中，在37 ℃, 200 r/min的條件培養6～8 h后，加入0.05 mol/L的 IPTG，在18 ℃，180 r/min 的條件下培養過夜。之后對菌體進行收集，通過底物轉化率以及菌體生物量篩選最佳培養基。

首先選取LB 培養基、TB 培養基、M9 培養基作為基礎培養基，之后在選定培養基的基礎上對其碳源、氮源以及無機鹽的種類進行優化。其中碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖。氮源包括酵母浸粉、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉膏、酵母浸粉與胰蛋白胨混合物。

確定碳源、氮源種類后，以培養基中的碳源、氮源以及無機鹽含量作為主要因素，以最終菌體的OD620值和丙谷二肽生成率作為響應值，利用Box-Behnken Design 方法建立響應面模型[22-23]，從而模擬出最佳的培養基組成。響應面設計情況如表1所示。

表1 響應面設計

1.4 高密度條件優化

以優化后的培養基為基礎培養基，在3 L發酵罐中對于高密度發酵中的影響因素進行研究。發酵參數為溫度37 ℃，pH 7.1，攪拌轉速200 r/min，溶氧通過O2和空氣混合氣通氣來調節[24]。菌體培養過程結束后向發酵罐中加入0.05 mol/L的 IPTG，在18 ℃，180 r/min 的條件下誘導外源蛋白表達。誘導結束后收集菌體，檢測底物轉化率。

首先研究pH對于發酵罐培養的影響，通過使用體積分數為50%的NH3·H2O調節pH值為7，另一組不調節pH。之后比較了補料種類對于發酵的影響，一組使用600 g/L的葡萄糖作為補料培養基，另外一組使用含有600 g/L的葡萄糖為碳源，48 g/L 的m(酵母浸粉)∶m(胰蛋白胨)=2∶1的混合氮源作為補料培養基。發酵5 h左右開始進行補料處理，補料速率為10 mL/h。實驗中除變量外其他發酵條件相同，檢測發酵過程中生物量與殘糖量。

補料方式對于高密度發酵有著很大的影響。發酵后5 h左右開始進行補料處理，分別使用2種方式：溶氧控制的補料，當溶氧>20%時開始補料，通過溶氧反饋級聯調節方式進行[25-26]；pH反饋控制補料，當pH>7.1時開始補料，通過pH反饋級聯調節方式進行[26-28]。其他發酵條件相同，檢測發酵過程中生物量與殘糖量。

1.5 丙谷二肽合成

取培養好的重組大腸桿菌，離心細胞，去上清液后重懸細胞，根據之前測出的OD620值稀釋，使得反應液中生物量相同，在7～10之間。在反應罐內加入1.46 g谷氨酰胺和2.79 g丙氨酸甲酯鹽酸鹽，加入90 mL 硼酸-硼砂緩沖液。在25 ℃下使用6 mol/L的NaOH溶液調節pH至8.5，加入10 mL 的重懸菌液開始反應。反應5 min 后取樣，離心取上清液，于4 ℃保存進行下一步檢測。

1.6 分析方法

產物有丙谷二肽、2種底物是丙氨酸甲酯鹽酸鹽、谷氨酰胺。首先對3種物質進行衍生化處理，之后進行高效液相色譜分析。通過紫外檢測器配C18色譜柱檢測。流動相A:V(乙酸鈉溶液)∶V(乙腈溶液)=93∶7,流動相B:純乙腈溶液,采用梯度洗脫的方式檢測丙谷二肽。流速1 mL/min，檢測器溫度40 ℃，檢測時間40 min，檢測波長254 nm。采用外標法測定樣品中丙谷二肽和谷氨酰胺的濃度，從而計算出丙谷二肽的濃度和底物的轉化率。

發酵過程中溶液的溶氧以及pH通過發酵罐自帶溶氧電極和pH電極進行檢測。每次使用前對電極進行校準。發酵過程中的殘糖量通過二硝基水楊酸法檢測。

菌株的生物量通過酶標儀進行檢測，檢測波長620 nm。

2 結果與討論

2.1 培養基成分優化

2.1.1 基礎培養基的篩選

基礎培養基為常用于培養大腸桿菌的LB培養基、TB培養基和M9培養基。3種培養基對于菌體生物量和底物轉化率的影響如圖2所示。在相同培養條件下，TB培養基的生物量>其他2種培養基的生物量，并且其底物轉化率也是最高的。因此選取TB 培養基為基礎,對培養基進行進一步的優化。

圖2 不同培養基下菌體的生物量和底物轉化率

2.1.2 TB培養基中碳源和氮源優化

在選定的TB培養基基礎上，僅改變培養基碳源種類，對菌體生物量和底物轉化率的影響結果見圖3。不同碳源對相同培養條件下菌體生物量與底物轉化率存在著一定影響。葡萄糖與果糖作為培養基碳源是較優的選擇。通過經濟性比較，最終選擇葡萄糖作為最終的培養基碳源。

A-乳糖；B-果糖；C-葡萄糖；D-甘油；E-半乳糖

保持其他培養基成分不變，僅改變氮源種類、菌體生物量和底物轉化率的變化見圖4。如圖4-a所示，不同氮源對相同培養條件下菌體生物量與底物轉化率存在著影響。單純使用酵母浸粉時，菌體生物量積累最明顯，但是底物轉化率較低；玉米漿作為氮源時，底物轉化率較高，但是生物量只有其他組的50%左右。綜合考慮，最終選擇同時具有較好的菌體生物量與底物轉化率的酵母浸粉與蛋白胨混合使用的氮源作為培養基氮源。圖4-b顯示混合氮源中2種物質的配比情況，發現m(酵母浸粉)∶m(胰蛋白胨)=2∶1時效果最好。

a-氮源對菌體的影響;b-混合氮源比例對菌體的影響

2.1.3 響應面分析法優化培養基配方

響應面分析根據表1設計的因素與水平進行實驗。最終實驗擬合模型如圖5所示。總模型方差顯著(P<0.05)，模型擬合相關度為95.26%，方差失擬項F值不顯著(P=0.131 4>0.05)。該模型與實際實驗擬合較好，可以用來模擬不同培養基配方對于菌體的生物量與底物轉化率的影響。

如圖5所示，任意2個因素之間均存在明顯的交互作用, 并且最優值落點均在試驗考察的區域范圍之內。最終確定基礎培養基的成分為：葡萄糖質量濃度為10 g/L，混合氮源[m(酵母浸粉)∶m(胰蛋白胨)=2∶1]質量濃度為24 g/L，無機鹽質量濃度為4.62 g/L KH2PO4和25.08 g/L K2HPO4。

圖5 響應面實驗各組三維圖與等高線圖

2.2 高密度培養條件優化

2.2.1 pH的影響

搖瓶實驗中無法及時調控pH，而在發酵罐發酵過程中，pH調節是重要的一步[29]。pH調節實驗結果如圖6所示。控制發酵罐中pH在7左右，菌體在發酵至5 h左右可以消耗完原始培養基中的葡萄糖，此時生物量也可以快速地達到較高水平，OD620最高可以達到6.3左右，菌體徹底烘干后的質量為5.34 g/L；未調節pH一組，菌體生長較緩慢，生物量也相對較差，最高OD620值僅為4.7，菌體徹底烘干后的質量為4.42 g/L。收集誘導后的細胞進行酶活性測試，沒有控制pH的重組細胞酶活性較低。pH對于菌體的生長速率和整體活性都具有重要的影響。因此在后續實驗中，都使用體積分數為50%的NH3·H2O調節pH至7。

圖6 pH對于菌體生物量與殘糖的影響

2.2.2 補料種類的影響

為進一步提高菌體密度，需要在培養過程中補料培養。由圖6可知，初始葡萄糖在發酵開始5 h左右幾乎完全消耗，因此選擇5 h左右開始進行補料。補料分為只補碳源和按比例補充碳源和氮源2種情況，實驗結果如圖7所示。可以看出，補料培養基為碳源或者碳源-氮源混合物對于生物量的影響不是很明顯。但補加碳源-氮源混合液可以促使菌體耗糖速率增加，推測補加氮源可以促進生物體合成一些物質，并且加快微生物對碳源的吸收[30]。通過重組菌的酶活力測定，也證明了我們的假設。因此補料培養基為碳源-氮源混合液更有利于菌體實現高密度水平以及表達蛋白。

圖7 補料方式對于菌體生物量與殘糖的影響

2.2.3 反饋補料方式的優化

發酵過程中基質濃度的變化對發酵過程存在重要影響。因為菌體的生長處于動態變化中，勻速補料的方式很難滿足需求。我們采用了溶氧反饋補料和pH反饋補料2種動態補料的方式來進行補料方式的優化，實驗結果如圖8所示。從實驗結果來看，采用2種不同反饋方式補料時，發酵過程中葡萄糖量一直處在較低水平，而菌體持續生長。對比恒溶氧反饋補料和恒pH反饋補料，可以看出恒溶氧反饋補料，碳源的利用速度更快，而生物量生長更多。接種后培養了27 h，恒溶氧反饋補料的生物量OD620達到58左右，而pH反饋補料的OD620值為43左右。在此基礎上加入IPTG進行外源蛋白的誘導表達。采用溶氧反饋補料時，誘導之后，菌體的生物量繼續增長，誘導3 h后，OD620值達到了67。而采用pH反饋補料時，添加誘導劑之后繼續培養3 h，菌體量基本維持不變，甚至出現了下降。因此，控制溶氧在20%的恒溶氧反饋補料更適于表達α-酯酰基轉移酶的重組大腸桿菌高密度培養。

圖8 反饋補料對于菌體生物量與殘糖的影響

2.3 高密度培養的重組菌用于丙谷二肽的生產

在大腸桿菌高密度發酵過程中，通過采取溶氧反饋補料的方式可以達到較高密度生物量。對高密度培養出的重組菌催化活性進行了測定。由表達轉酯酶的重組菌催化的反應如圖9所示。

圖9 丙谷二肽合成反應式

用溶氧反饋補料培養后的菌體作為全細胞催化劑，進行丙谷二肽的酶催化合成。2種底物丙氨酸甲酯鹽酸鹽和谷氨酰胺，濃度分別為400與300 mmol/L，在重組菌體濃度OD620為0.7時，反應5 min，丙谷二肽的生成率達到34.56 g/L，生產效率約為7 g/(L·min)，說明高密度條件下的重組大腸桿菌仍然保持了高活性，可保障該重組大腸桿菌在丙谷二肽的工業化生產中的應用，且能大幅度降低生產成本。為生物發酵法進行丙谷二肽制備的產業化提供了技術支持。

3 結論

國外市場上，丙谷二肽常被加入到保健品、飲品中，應用廣泛，而目前國內丙谷二肽的產品則較為單一。隨著中國對醫療衛生行業的重視程度加大以及老齡化現狀的加劇，近些年人們對于丙谷二肽產品興趣增大，如何實現微生物酶法生產丙谷二肽的工業化生產成了急需解決的問題。有關高密度培養重組菌生產丙谷二肽的方法尚未見報道。本實驗先對搖瓶培養過程中培養基的種類、碳源、氮源進行篩選，最終通過響應面水平優化，確定了表達α-酯酰基轉移酶的重組大腸桿菌的基礎培養基。在此基礎上，在3 L發酵罐中考察對于發酵中的補料類型、補料方式等，建立了溶氧反饋補料培養工藝。最終高密度條件下培養的重組菌株，其細胞密度達到搖瓶水平的14倍；同時，高密度條件下培養的重組菌株，丙谷二肽的質量濃度達到34.56 g/L，生產效率為7 g/(L·min)，為目前文獻報道最高水平。本研究為進一步工藝放大，實現丙谷二肽工業化生產奠定了基礎。