阿魏蘑漆酶同工酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

苑暢，趙麗婷，顧正華，李由然，石貴陽，丁重陽*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

漆酶(laccase, EC 1.10.3.2)是一種新型的綠色環(huán)保酶，能夠?qū)?50余種化合物氧化成水等副產(chǎn)物[1-3]，具有作用底物廣泛且不污染環(huán)境的特點[4]，研究者對其在食品領(lǐng)域如食用菌栽培、果汁加工、葡萄酒釀造、食品檢測及食品廢水處理等方面的研究日漸深入[5]，同時在印染和環(huán)保等其他工業(yè)領(lǐng)域中，漆酶也具有巨大的應(yīng)用價值[6-7]。

共培養(yǎng)是提高漆酶發(fā)酵水平的有效方法之一[8]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，不產(chǎn)漆酶菌株膠紅酵母(Rhodotorularmucilaginosa)與產(chǎn)漆酶菌株阿魏蘑(Pleurotuseryngiivar.ferulae)進(jìn)行共培養(yǎng)時，可以有效提高漆酶發(fā)酵水平[9]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后漆酶同工酶的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化，其中基因lacc2轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，而lacc6轉(zhuǎn)錄水平大幅下調(diào)，但具體的作用機(jī)制仍不清晰[10]。由于從阿魏蘑發(fā)酵液中分離純化漆酶的同工酶存在一定困難，本研究對阿魏蘑lacc2和lacc6進(jìn)行了分子克隆、異源表達(dá)和分離純化，得到2個重組漆酶LACC2和LACC6，并分析比較了2種酶在酶學(xué)性質(zhì)方面的差異，以期為共培養(yǎng)過程中膠紅酵母促進(jìn)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的作用機(jī)理分析提供同工酶酶學(xué)性質(zhì)方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以利于促進(jìn)對機(jī)理的全面解析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

阿魏蘑JM301、畢赤酵母GS115、大腸桿菌JM109以及表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，均由本實驗室保藏。

YPD培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium)(g/L)：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，無水葡萄糖20.0。

BMGY培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium)(g/L)：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，YNB 13.4，K2HPO43.0，KH2PO411.8，甘油10 mL/L，生物素0.4 mg/L。

BMMY培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium)(g/L)：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，YNB 13.4，K2HPO43.0，KH2PO411.8，生物素0.4 mg/L。

MD培養(yǎng)基(minimal extrase medium)(g/L)：YNB 13.4，無水葡萄糖20.0，生物素0.4 mg/L。

1.1.2 主要試劑和儀器

實驗中所用遺傳霉素(geneticin, G418)和限制性核酸內(nèi)切酶SnaB Ⅰ、EcoR Ⅰ、NotI購自Thermo Fisher Scientific公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS]、丁香醛連氮(syringaldazine, SGZ)、2,6-二甲氧苯酚(2,6-dimethoxyphenol, 2,6-DMP)、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚, Sigma公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、曲拉通、吐溫40、吐溫80、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)、L-半胱氨酸，北京索萊寶科技有限公司；酶標(biāo)儀，TECAN公司；電轉(zhuǎn)儀，Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6的擴(kuò)增

利用信號肽在線預(yù)測網(wǎng)站SignalP 4.0預(yù)測漆酶基因lacc2和lacc6中的信號肽位置。設(shè)計引物去除漆酶基因序列中的信號肽，并在序列的5’端添加SnaBⅠ(或EcoRⅠ)酶切位點、His蛋白標(biāo)簽及thrombin位點，3’端僅添加NotI酶切位點。提取阿魏蘑中RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，擴(kuò)增得到漆酶基因lacc2和lacc6。

1.2.2 重組菌的構(gòu)建及篩選

利用SnaBⅠ(或EcoRⅠ)及NotⅠ對基因片段lacc2、lacc6和質(zhì)粒pPIC9K雙酶切，連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6。將StuI線性化的空質(zhì)粒pPIC9K及2個重組質(zhì)粒純化回收后轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)2.5 h后將菌液均勻涂布至MD平板，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)36 h。從MD平板中隨機(jī)挑選出單菌落至帶有G418抗性的YPD平板上，利用添加了不同質(zhì)量濃度(0.25、 1、 2、 4 mg/mL)G418的平板篩選出高拷貝數(shù)的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 基因lacc2和lacc6在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組菌株GS115/pPIC9K-lacc2、GS115/pPIC9K-lacc6和轉(zhuǎn)入了空質(zhì)粒的對照組菌株GS115/pPIC9K接種至YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在30 ℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)20～24 h。以體積分?jǐn)?shù)1.5%的接種量轉(zhuǎn)接到已提前加入生物素的BMGY培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)18～20 h，離心發(fā)酵液后收集菌體并將其轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h補(bǔ)加無水甲醇使終體積分?jǐn)?shù)始終保持在1.0%，離心菌液后棄掉菌體，獲得的上清液即為重組漆酶的粗酶液。

1.2.4 酶活力的測定

采用ABTS法測定酶活力，具體測定方法及酶活力計算公式參照文獻(xiàn)[11]。

酶活力定義：1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol ABTS所需的漆酶酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.5 蛋白純化以及分析

利用鎳柱對重組漆酶LACC2和LACC6的粗酶液進(jìn)行純化，收集純化后的酶液，再利用凝血酶去除純化蛋白的His標(biāo)簽，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)對其進(jìn)行分析檢測。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

以下測定中所用酶液均為電泳純的酶液，提前配制好濃度為50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉溶液作為緩沖液。除動力學(xué)常數(shù)測定之外，測定中所用底物均為ABTS。每個測定條件設(shè)置3個平行。

(1)LACC2和LACC6的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性：4 ℃條件下將LACC2和LACC6分別在pH 2～10的緩沖液中測定酶活力，以酶活力的最高值為100%。繼續(xù)將2個重組漆酶在不同pH的緩沖液中保存，每隔一段時間測定剩余酶活力，探究LACC2和LACC6的pH穩(wěn)定性。

(2)LACC2和LACC6的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性：將LACC2和LACC6分別在20～90 ℃的條件下保溫5 min后測定酶活力，以酶活力的最高值為100%。繼續(xù)將2個重組漆酶在不同溫度下保存，每隔一段時間測定剩余酶活力，探究LACC2和LACC6的溫度穩(wěn)定性。

(3)金屬離子對LACC2和LACC6的影響：向反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子(K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Al3+和Ba2+)至終濃度為0.1、1.0和5.0 mmol/L，測定漆酶剩余的酶活力，以不添加金屬離子的漆酶酶活力為100%。

(4)有機(jī)試劑對LACC2和LACC6的影響：向反應(yīng)體系中加入不同有機(jī)試劑(甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇和乙腈)至終體積分?jǐn)?shù)為5%和10%，測定漆酶剩余的酶活力，以不添加有機(jī)試劑的漆酶酶活力為100%。

(5)表面活性劑對LACC2和LACC6的影響：向反應(yīng)體系中加入不同表面活性劑(SDS、曲拉通、吐溫40和吐溫80)至終體積分?jǐn)?shù)為0.1%和0.5%，測定漆酶剩余的酶活力，以不加表面活性劑的漆酶酶活力為100%。

(6)抑制劑對LACC2和LACC6的影響：向反應(yīng)體系中添加不同的抑制劑(EDTA、DTT、PMSF和L-半胱氨酸)至終濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L，測定漆酶剩余的酶活力，以不加抑制劑的漆酶酶活力為100%。

(7)動力學(xué)常數(shù)測定：選擇不同濃度的底物(ABTS、2,6-DMP、SGZ、鄰苯二酚和愈創(chuàng)木酚)，在30 ℃時與純化酶液進(jìn)行反應(yīng)。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[12]對LACC2和LACC6的Km值以及Kcat/Km值進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶基因lacc2和lacc6的克隆及重組菌的獲得

如圖1-a所示，2個基因片段lacc2和lacc6的條帶位置與預(yù)測核酸大小1 566和1 602 bp相符。重組質(zhì)粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6構(gòu)建完成后，利用SnaBⅠ(或EcoRⅠ)和NotⅠ對其進(jìn)行雙酶切驗證，如圖1-b所示，均獲得2條約9.3和1.6 kb的條帶。將StuI線性化后的空質(zhì)粒和2個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入提前制備好的畢赤酵母感受態(tài)中，再利用G418濃度逐漸提高的YPD平板挑選出陽性轉(zhuǎn)化子，最終得到對照菌株GS115/pPIC9K，重組菌株GS115/pPIC9K-lacc2和GS115/pPIC9K-lacc6。

a- lacc2和lacc6基因擴(kuò)增結(jié)果;b-重組質(zhì)粒酶切鑒定M-DNA Maker; a1-基因lacc2; a2-基因lacc6; b1-pPIC9K質(zhì)粒;b2-重組質(zhì)粒pPIC9K-lacc2; b3-重組質(zhì)粒pPIC9K-lacc6

2.2 重組漆酶的誘導(dǎo)表達(dá)、酶活力檢測及純化

對照菌株GS115/pPIC9K、重組菌株GS115/pPIC9K-lacc2和GS115/pPIC9K-lacc6經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，離心得到發(fā)酵上清液。以ABTS為底物時，測得重組漆酶LACC2和LACC6的粗酶液酶活力為0.35和7.37 U/mL，而對照組粗酶液中未檢測到酶活力，說明2條漆酶基因在畢赤酵母中成功表達(dá)。使用鎳柱對重組蛋白LACC2和LACC6的粗酶液進(jìn)行純化，采用凝血酶去除His標(biāo)簽蛋白，獲得純化酶液。重組漆酶LACC2和LACC6的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2所示。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker；1-重組菌株GS115/pPIC9K-lacc6純化酶液；2-重組菌株GS115/pPIC9K-lacc2純化酶液

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

如圖3所示，LACC2和LACC6的最適反應(yīng)pH值均為3.0。當(dāng)pH 2.0時LACC6幾乎完全失活，pH>3.0時LACC6的相對酶活力隨pH的升高而快速下降，而LACC2酶活力下降程度相對更為緩慢。不同pH條件下，LACC2表現(xiàn)出比LACC6更高的pH穩(wěn)定性，尤其在最適pH時，LACC2的半衰期為24 h，而LACC6的半衰期僅為12 h，說明LACC2比LACC6具有更強(qiáng)的對酸堿環(huán)境的耐受力。

a- LACC2的最適pH;b- LACC6的最適pH;c- LACC2的pH穩(wěn)定性;d- LACC6的pH穩(wěn)定性

2.3.2 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

如圖4所示，LACC2和LACC6的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃，與大部分白腐真菌漆酶性質(zhì)相近[13]。雖然LACC2和LACC6的最適溫度較高，但是2個重組漆酶在高溫下穩(wěn)定性較差并且溫度越高失活越快，由圖4可知，30 ℃下LACC2和LACC6表現(xiàn)出最佳的熱穩(wěn)定性，半衰期分別為15和30 h。此外，較之LACC2，LACC6的溫度穩(wěn)定性相對更高，但這也僅僅局限于40 ℃以下的溫度環(huán)境中。

a- LACC2的最適溫度;b- LACC6的最適溫度;c- LACC2的溫度穩(wěn)定性;d- LACC6的溫度穩(wěn)定性

2.3.3 金屬離子對酶活力的影響

金屬離子對不同漆酶的作用效果各不相同。有研究表明，添加低濃度的Cu2+能夠在一定程度上提高Pleurotusostreatus漆酶的酶活力[14]，但對M.Fructigena的漆酶活性卻沒有促進(jìn)作用[15]。還有研究指出，Zn2+和Al3+等金屬離子能夠通過與Cu2+搶奪結(jié)合位點，從而改變漆酶蛋白的結(jié)構(gòu)，達(dá)到抑制漆酶活性的效果[16]，然而卻可對P.ostreatusC1 mutagenic strain F-13[17]漆酶的酶活力起到促進(jìn)作用。

12種金屬離子對LACC2和LACC6酶活力的影響,如圖5所示。

a-金屬離子對LACC2的影響;b-金屬離子對LACC6的影響

低濃度的K+、Cu2+、Co2+和Mn2+均會對LACC2和LACC6的酶活力產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)2個漆酶的酶活力均會隨著金屬離子濃度的逐漸增大而提高。將金屬離子濃度增大至5 mmol/L時，LACC2和LACC6酶活力基本受到抑制，但整體而言，LACC2相對酶活力降低程度較小，反映出LACC2比LACC6具有更強(qiáng)的高濃度金屬離子耐受力。Fe2+和Fe3+對LACC2和LACC6的抑制作用顯著，當(dāng)添加1.0 mmol/L濃度的Fe2+時LACC2和LACC6可完全失活，這與其他來源的漆酶性質(zhì)相符，F(xiàn)e2+可與底物ABTS自由基結(jié)合從而抑制漆酶酶活力[18]，F(xiàn)e3+可通過與漆酶中Cu2+搶奪結(jié)合位點，改變漆酶的蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制漆酶的活性[19]。

由圖5可知，相較于LACC6，低濃度金屬離子對LACC2的激活力作用更為明顯。分別添加0.1和1.0 mmol/L濃度的K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Al3+和Ba2+均可提高LACC2的酶活力，而可使LACC6酶活力提高的金屬離子僅有K+、Cu2+、Co2+和Mn2+，且相對酶活力的增幅普遍不及LACC2。這些研究結(jié)果均表明LACC2的金屬離子依賴性較LACC6更高。

2.3.4 有機(jī)溶劑對酶活力的影響

如圖6所示，甲醇、丙酮、異丙醇、正丁醇和乙腈均對LACC2和LACC6有一定程度的抑制作用。相較于LACC6，LACC2受到有機(jī)溶劑影響較小，在體積分?jǐn)?shù)5%和10%的添加量下，LACC2的相對酶活力均在80%以上，而LACC6的相對酶活力在高有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)(10%)下基本低于80%，這也說明LACC2具有更強(qiáng)的高濃度有機(jī)溶劑耐受力。

a-有機(jī)溶劑對LACC2的影響;b-有機(jī)溶劑對LACC6的影響

2.3.5 表面活性劑對酶活力的影響

表面活性劑SDS、曲拉通、吐溫40和吐溫80對LACC2和LACC6酶活力的影響如圖7所示，當(dāng)添加體積分?jǐn)?shù)0.1%的表面活性劑時，LACC2酶活力得到一定的激活，其中添加曲拉通時LACC2相對酶活力最高，與對照相比提高了9.2%；然而LACC6酶活力卻受到輕微的抑制，添加SDS時酶活力降低最多，相對酶活力僅剩73.5%。當(dāng)表面活性劑的添加體積分?jǐn)?shù)增大至0.5%時，LACC6受到的抑制作用與LACC2相比更加明顯，SDS可使其相對酶活力降低46.4%；LACC2則僅僅受到SDS的強(qiáng)烈抑制作用，相對酶活力降低了75.2%，其他表面活性劑對其酶活力影響微弱。總體來說，相較于LACC6，LACC2對表面活性劑的耐受力更強(qiáng)，不易受到大多數(shù)表面活性劑的抑制，且在適當(dāng)添加濃度下酶活力可得到促進(jìn)，另外，添加體積分?jǐn)?shù)0.5% SDS則可有效抑制LACC2的酶活力。

a-抑制劑對LACC2的影響;b-抑制劑對LACC6的影響

2.3.6 抑制劑對酶活力的影響

如圖8所示，EDTA、DTT、PMSF和L-半胱氨酸對2個重組漆酶均有抑制作用。其中，DTT和L-半胱氨酸對LACC2和LACC6的抑制效果最為明顯，兩者添加濃度為0.5 mmol/L時可完全抑制LACC2和LACC6的酶活力。EDTA作為常見的陽離子金屬螯合劑，可吸附反應(yīng)體系中的Cu2+形成Cu2+-EDTA配合物。由圖8可知，LACC2對EDTA更為敏感，低濃度EDTA即可實現(xiàn)對LACC2的抑制使其相對酶活力為71.4%，而當(dāng)實驗中EDTA的添加濃度提高至1 mmol/L時，LACC6酶活力才顯著降低，相對酶活力為72.8%。LACC2對EDTA表現(xiàn)出較低的耐受力，說明LACC2金屬離子的依賴性較LACC6更高。

a-表面活性劑對LACC2的影響;b-表面活性劑對LACC6的影響

2.3.7 重組漆酶的底物動力學(xué)研究

以ABTS、2,6-DMP、SGZ、鄰苯二酚和愈創(chuàng)木酚為底物，測得LACC2和LACC6的Km值并計算得到Kcat/Km值，結(jié)果如表1所示。

表1 酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

結(jié)果表明，以ABTS為底物時，LACC2和LACC6的Km值最小，分別為0.13和0.24 mmol/L，其中LACC2對底物ABTS的親和力更高；LACC2和LACC6的Kcat/Km值最大，表明2個重組漆酶對ABTS的催化效率最高，LACC2和LACC6的最適底物均為ABTS。此外，LACC2和LACC6對2,6-DMP和鄰苯二酚也有較好的催化效果。其他來源漆酶的酶學(xué)性質(zhì)比較如表2所示，LACC2和LACC6的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度均與大多數(shù)真菌漆酶相同，然而，不同來源漆酶的最適底物卻是不同的。與其他來源的漆酶相比，LACC2和LACC6的Km值處于較低的水平，均對ABTS具備更佳的親和力和良好的催化特性。

表2 不同來源漆酶的酶學(xué)性質(zhì)

3 結(jié)論

前期研究發(fā)現(xiàn)，阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)可促進(jìn)漆酶酶活力，并且在這一過程中l(wèi)acc2轉(zhuǎn)錄水平顯著提高而lacc6轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。針對這一發(fā)現(xiàn)，本文將阿魏蘑漆酶lacc2和lacc6異源表達(dá)后展開了對2個重組漆酶酶學(xué)性質(zhì)的比較分析。與大多數(shù)真菌漆酶相同，以ABTS為底物時，LACC2和LACC6的最適反應(yīng)pH值均為3.0，且LACC2在不同酸堿度下均表現(xiàn)出相對更高的穩(wěn)定性；LACC2和LACC6的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃，但在高溫環(huán)境(>40 ℃)下穩(wěn)定性都不佳。低濃度的K+、Cu2+、Co2+和Mn2+對LACC2和LACC6均有不同程度的促進(jìn)作用，而Fe2+和Fe3+對LACC2和LACC6的抑制效果則十分顯著，根據(jù)相對酶活力的變化程度和規(guī)律，可知LACC2的金屬依賴性比LACC6更強(qiáng)。相較于LACC6，LACC2表現(xiàn)出對有機(jī)溶劑和表面活性劑更強(qiáng)的耐受力，但更易受到抑制劑的影響。動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，LACC2和LACC6的最適底物均為ABTS，LACC2的Km值低于LACC6，分別為0.13和0.24 mmol/L。這一研究結(jié)果有助于全面了解阿魏蘑漆酶中主要同工酶酶學(xué)性質(zhì)的異同，有利于對共培養(yǎng)過程中膠紅酵母促進(jìn)阿魏蘑漆酶發(fā)酵水平作用機(jī)理進(jìn)行深入研究。