人臍帶間充質干細胞來源外泌體促進小膠質細胞向M2極化

周新茹， 金倩， 張蕾蕾， 吳佩佩， 傅強， 錢暉

(1. 江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013； 2. 上海交通大學附屬第一人民醫院脊柱外科， 上海 200080)

小膠質細胞是中樞神經系統的天然免疫細胞，與多種神經退行性疾病和腦炎性疾病的發病機制有關。它起源于胚胎卵黃囊原始髓系祖細胞[1-2]，占腦部組織細胞5%～15%[3]。小膠質細胞通過其獨具特點的“分枝”狀結構，行使清除損壞組織、阻止毒性和死亡擴展的免疫學作用。此外，小膠質細胞可通過調控軸突生長、髓鞘形成和突觸重塑來促進神經連接，從而調節神經發生、神經膠質形成和神經元遷移[4-6]。研究表明M1極化態小膠質細胞可加劇組織損傷，M2極化態有助于減少炎癥并促進組織修復[7]。中風、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神經退行性疾病可致M1小膠質細胞過度極化，加重組織損傷。

本課題組前期研究表明，人臍帶間充質干細胞外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes，hucMSC-Ex)可通過降低炎癥反應緩解腸炎、減少皮膚燙傷程度和腎損傷等[8-11]。在此基礎上，本研究旨在探討hucMSC-Ex能否通過促進小膠質細胞向M2極化以減少炎癥反應，為治療炎癥性相關神經系統疾病提供可靠的治療方案。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

大鼠小膠質細胞購自上海鈺博生物科技有限公司；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS，日本Sigma公司)，兔抗人CD9單克隆抗體(美國CST公司)，兔抗人CD63/CD81多克隆抗體(美國Proteintech公司)，兔抗大鼠Iba1多克隆抗體(英國Abcam公司)，小鼠抗大鼠iNOS/Arg1單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnolog公司)，兔抗大鼠p-NF-κB p65/NF-κB(美國CST公司)，兔抗大鼠β-肌動蛋白(美國Bioworld公司)，HRP標記抗兔/鼠IgG二抗(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀公司)，ELISA試劑盒(中國Excell Bio公司)，外泌體提取試劑盒(美國SBI公司)；Stepone plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，ImageQuant LAS 4000 mini化學發光成像儀、激光掃描共聚焦顯微鏡(美國GE公司)，納米顆粒分析儀(德國Particle Metrix公司)，FEI Tecnai 12透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)。

1.2 hucMSCs培養及其外泌體分離

體外分離擴增hucMSCs，采用10% 胎牛血清的α-MEM培養基在37 ℃、5% CO2條件下培養。hucMSCs細胞融合率達70%～80% 時，棄上清液，PBS洗滌后更換為相應的不加血清空白培養液繼續培養48 h，收集上清液立即置4 ℃、300×g離心10 min去除漂浮細胞等雜質，-80 ℃保存備用。應用外泌體提取試劑盒，結合超速離心法獲得濃縮hucMSC-Ex，BCA蛋白定量試劑盒檢測hucMSC-Ex總蛋白濃度。

1.3 透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術檢測hucMSC-Ex形態與粒徑大小

準備100 μL(濃度約為5.0×107個/mL)hucMSC-Ex，納米顆粒分析儀進行粒徑檢測及數據分析。一次取20 μL hucMSC-Ex，混勻后滴加在銅網上，室溫靜置5 min，吸去殘余液體后倒扣于30 g/L 磷鎢酸(pH 6.8)液滴上，負染5 min，烘干后置于透射電鏡下觀察拍照。

1.4 蛋白質印跡法檢測hucMSC-Ex表面分子、小膠質細胞表型標志物及信號通路相關蛋白

預先配置12% SDS-PAGE膠，200 μg蛋白量上樣，80 V電泳，350 mA/120 min電轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別與CD9抗體(1 ∶ 500)、CD63抗體(1 ∶ 500)、CD81抗體(1 ∶ 500)、β-肌動蛋白抗體(1 ∶ 10 000)、iNOS抗體(1 ∶ 50)、Arg1抗體(1 ∶ 50)、兔抗大鼠p-NF-κB抗體(1 ∶ 500)、兔抗大鼠NF-κB抗體(1 ∶ 500)孵育，4 ℃過夜，TBS/T洗滌后，與HRP標記抗兔/鼠IgG二抗37 ℃ 溫育1 h，TBS/T洗滌，加入預先混合的 HRP化學發光底物，至化學發光成像儀檢測。

1.5 免疫熒光檢測小膠質細胞標志物Iba1表達

將小膠質細胞分為3組，分別用PBS(PBS組)、1 μg/mL LPS(LPS組)、1 μg/mL LPS加100 μg/mL hucMSC-Ex(LPS+hucMSC-Ex組)處理12 h。PBS、LPS和hucMSC-Ex處理過的小膠質細胞玻片用PBS清洗后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗；5% Triton室溫破膜15 min，PBS清洗；濾紙吸干多余液體，滴加5% BSA，室溫封閉30 min；去封閉液，直接滴加Iba1(1 ∶ 300稀釋)抗體放入濕盒，4 ℃孵育過夜，TBS/T清洗；滴加稀釋好的熒光二抗(注意避光)，于濕盒中37 ℃孵育1 h，TBS/T 清洗；DAPI染核，避光孵育10 min，TBS/T 清洗；封片固定，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.6 qRT-PCR檢測IL-1β mRNA和IL-10 mRNA

收集小膠質細胞(約5×105個)，加入1 mL Trizol試劑提取細胞總RNA，按產品說明書將RNA逆轉錄成cDNA，置-20 ℃保存。qRT-PCR反應體系20 μL，包括2×Ultra SYBR Mixture(High ROX)10 μL、前向引物0.5 μL、后向引物0.5 μL、cDNA 2 μL、無RNA酶H2O 7 μL。參數設置： 95 ℃ 預變性15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個循環，重復3次。

1.7 ELISA檢測小膠質細胞上清液中IL-1β和IL-10的濃度

收集處理后的小膠質細胞上清液1 mL，按產品說明書操作，繪制標準曲線并求出標本中IL-1β和IL-10的濃度。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 hucMSCs原代培養及hucMSC-Ex鑒定

圖1A為P1代hucMSCs典型形態。收集P3至P8代hucMSCs無血清外泌體培養上清液提取hucMSC-Ex，透射電鏡觀察囊泡的形態，呈典型的膜性“杯盤”狀形態(圖1B)，納米顆粒跟蹤分析檢測hucMSC-Ex的粒徑大小為(119.7±47.9)nm(圖1C)。免疫印跡法檢測hucMSC-Ex表達CD9、CD63和CD81表面分子(圖1D)。以上結果顯示成功分離了hucMSC-Ex。

A： P1代hucMSCs典型形態(×40)；B：透射電鏡顯示hucMSC-Ex典型形態(×12 500)； C：納米顆粒跟蹤分析檢測hucMSC-Ex粒徑分布；D：免疫印跡法檢測hucMSC-Ex表面標志物

2.2 hucMSC-Ex促進小膠質細胞向M2極化

細胞免疫熒光檢測結果顯示LPS組Iba1較PBS組高表達，LPS+hucMSC-Ex組Iba1增加更明顯(圖2A)，說明hucMSC-Ex可以進一步促進小膠質細胞活化。免疫印跡法檢測M1極化態標志物iNOS和M2極化態標志物Arg1的表達，結果表明hucMSC-Ex能夠減少iNOS的表達、增加Arg1的表達，同時也發現hucMSC-Ex能夠抑制NF-κB的磷酸化(圖2B)。qRT-PCR結果也顯示hucMSC-Ex能夠減少小膠質細胞IL-1β mRNA表達(P<0.05)，上調IL-10 mRNA表達(P<0.05)見圖2C, 2D。以上結果提示hucMSC-Ex可能通過抑制NF-κB的活化促進小膠質細胞由M1型向M2型極化。

2.3 hucMSC-Ex促進小膠質細胞向M2極化以減少炎癥反應

收集處理12 h后PBS組、LPS組和LPS+hucMSC-Ex組細胞上清液，ELISA檢測上清液中炎癥因子IL-1β和IL-10的含量(圖3)，結果顯示hucMSC-Ex組較LPS組促炎因子IL-1β分泌減少(P<0.05)，抑炎因子IL-10分泌增加(P<0.01)。表明hucMSC-Ex可以減少小膠質細胞促炎因子和增加抑炎因子的分泌。

A：免疫熒光檢測小膠質細胞標志物Iba1表達(×600)；B：免疫印跡法檢測小膠質細胞極化態標志物變化；C、D：qRT-PCR檢測小膠質細胞IL-1β、IL-10的表達

圖3 不同處理組小膠質細胞上清液中細胞因子的變化

3 討論

由于腦部功能的復雜性，神經退行性疾病的治療一直是個難題，主要原因在于組織難以再生和持續性神經炎癥等。已有文獻報道，干細胞移植可用來治療神經退行性疾病[12-14]，而外泌體非細胞療法與干細胞治療相比具有減少免疫排斥、利于保存、取用方便和減少炎癥等優勢。小膠質細胞是中樞神經系統主要的免疫細胞，本研究聚焦于hucMSC-Ex促進小膠質細胞極化，降低神經炎癥研究。

小膠質細胞可分為三種狀態，即M0靜息態、由LPS和(或)IFN-γ激活的M1極化態小膠質細胞、由IL-4和(或)IL-13激活的M2極化態小膠質細胞[15]。M1極化態小膠質細胞釋放大量的促炎性因子(IL-1β、TNF-α等)，氧化還原分子(氧化酶、iNOS等)，趨化因子和MHC-I等，可作為M1極化態的標志物[16-17]；M2極化態小膠質細胞則誘導Arg1、Ym1和MMR表達，可作為M2極化態的標志物[18]。本研究結果發現hucMSC-Ex能夠促進LPS誘導的小膠質細胞iNOS蛋白減少、Arg1蛋白增加、IL-1β mRNA減少和IL-10 mRNA增加，且上清液中促炎因子IL-1β減少、抑炎因子IL-10增加，同時也發現hucMSC-Ex能夠減少NF-κB的活化。NF-κB被認為是炎癥介質的中心轉錄因子，在小膠質細胞極化和其介導的中樞神經炎癥反應過程中起著至關重要的作用[19-20]。在創傷性腦損傷研究中發現，ω-3PUFA通過SIRT1介導的HMGB1/NF-κB途徑的去乙?；饔谜{節小膠質細胞極化來減弱炎癥反應[21]。在急性缺血性腦卒中的研究中發現，Notch信號可通過使NF-κB通路蛋白泛素化，進而影響小膠質細胞極化態轉變[22]。故我們猜想hucMSC-Ex有可能也是通過減少NF-κB的活化而發揮轉變小膠質細胞極化態的作用。以上結果表明hucMSC-Ex能夠促進M1小膠質細胞向M2極化以減少炎癥因子分泌，為治療炎癥相關神經退行性疾病提供新的治療方法。

該研究探討了hucMSC-Ex可能通過抑制NF-κB信號促進炎癥型小膠質細胞向抑炎表型轉化，但其進一步的作用機制仍需深入探討。因不同藥物單獨或聯合刺激，M1極化態小膠質細胞顯示不同的功能。因此，使用不同藥物單獨或聯合刺激小膠質細胞，hucMSC-Ex能否誘導其向非炎癥型極化以及其中的具體機制需要進一步研究。后繼研究中，我們將hucMSC-Ex應用于動物模型中，從體內外兩方面，進一步探討hucMSC-Ex在治療神經退行性疾病中的作用。