粉防己堿對人結直腸癌HCT116細胞株生物功能的影響及其機制

王月霞， 張治進， 張玉浩， 傅駿， 秦賢舉

(1. 江蘇大學醫(yī)學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 上海市第八人民醫(yī)院胃腸外科， 上海 200235)

結直腸癌占腫瘤發(fā)病率10.2%，死亡率僅次于肺癌，占全球癌癥相關死亡9.2%[1]。化療是結直腸癌輔助治療的重要策略之一。天然產(chǎn)物因具有生物友好性和較好的治療效果，在腫瘤化療藥物研發(fā)領域得到越來越多關注[2-3]。粉防己堿是一種可用于腫瘤化療的天然生物堿，其作為傳統(tǒng)中藥在治療矽肺、關節(jié)炎和高血壓等疾病中發(fā)揮重要作用[4-7]。近來，關于粉防己堿的抗腫瘤作用得到廣泛研究，其主要通過靶向多條信號通路抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，如通過介導細胞內線粒體途徑及胞外死亡受體途徑誘導前列腺癌細胞凋亡[8]；通過上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21誘導肺癌細胞凋亡[9]；通過介導caspase依賴的細胞凋亡途徑抑制口腔癌細胞增殖[10]等；但關于粉防己堿對腫瘤細胞遷移的影響還不清楚。HCT116是一種以侵襲遷移為特征的人結直腸癌低分化細胞株，具有干細胞特性[11]。本研究旨在探討粉防己堿對高惡性人結直腸癌HCT116細胞株生物功能的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結直腸癌HCT116細胞株(中國科學院上海生物化學研究所)；DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰酶(美國Gibco公司)；粉防己堿(美國Selleck公司)；CCK-8試劑(日本Dojindo公司)；Annexin V細胞凋亡檢測試劑(美國BD公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和Hoechst 33342細胞核染色液(上海碧云天生物公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海生工生物公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；兔單克隆抗體E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(PKB/AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、核因子激活的B細胞κ 輕鏈增強蛋白(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)均為美國CST公司產(chǎn)品；兔單克隆抗體GAPDH(英國Abcam公司)；HRP標記的羊抗兔二抗(美國Jackson公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HCT116細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM中，于37 ℃，5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測細胞活力 將對數(shù)期細胞以7×103/孔密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h；以二甲基亞砜為對照，分別加入100 μL不同濃度的粉防己堿(2.5、5、10、20、40和80 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μL CCK-8試劑，每組設置5個復孔，37 ℃孵育2 h；酶標儀測定450 nm處吸光度，計算細胞存活率及粉防己堿半數(shù)抑制濃度(semi inhibition concentration，IC50)。后續(xù)實驗均將對數(shù)期HCT116細胞接種于6孔板，孵育過夜；次日，以二甲基亞砜為對照，小于IC50粉防己堿(2.5、5、10 μmol/L)處理細胞后，對應實驗檢測粉防己堿對細胞生物功能的影響。

1.2.3 克隆形成實驗測定細胞增殖能力 粉防己堿處理細胞48 h；胰酶消化，PBS清洗后收集細胞，以300個/孔密度接種于6孔板，每組設置3個復孔，培養(yǎng)14 d，在此期間，每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基；待克隆細胞長至合適大小時終止培養(yǎng)， 4%低聚甲醛固定細胞30 min；0.1%結晶紫染色20 min；拍照后Image J軟件計數(shù)。

1.2.4 流式細胞術測定細胞分布周期和凋亡 粉防己堿處理細胞24 h；胰酶(不含EDTA)消化，PBS清洗后收集細胞；取部分細胞用70%乙醇4 ℃固定2 h；25 μL碘化丙錠常溫避光孵育30 min；流式細胞儀分析細胞周期分布；同時，根據(jù)Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書，用300 μL 1×結合緩沖液重新懸浮剩余細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，避光孵育15 min；加入5 μL碘化丙錠避光孵育5 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡；每組設置3個復孔，每次至少計數(shù)10 000個細胞。

1.2.5 熒光染色檢測細胞早期凋亡 粉防己堿處理細胞24 h；PBS洗滌；分別加入1 mL 線粒體膜電位檢測試劑JC-1 和Hoechst 33342染色工作液，每組設置3個復孔，37 ℃孵育20 min；PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 粉防己堿處理細胞24 h；胰酶消化，PBS清洗后無血清培基重懸細胞，分別以3×104/孔密度接種至Transwell小室，下室加600 μL含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，37 ℃培養(yǎng)22 h，4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗，顯微鏡觀察拍照，Image J軟件計數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗測定細胞遷移能力 粉防己堿處理細胞24 h；PBS清洗后槍頭垂直劃痕，控制劃痕寬度在300～500 μm之間，PBS清洗劃落細胞，更換無血清培基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0、48和72 h觀察拍照，Image J軟件計算遷移面積。

1.2.8 蛋白印跡實驗分析蛋白表達水平 粉防己堿處理細胞48 h；收集細胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA測定蛋白濃度；蛋白煮沸變性；配制10% 分離膠及濃縮膠；加樣后，以70 V恒壓，再以120 V恒壓行SDS-PAGE分離蛋白；恒流350 mA，4 ℃ 2 h半干電轉法將蛋白轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；4℃孵育抗體過夜(實驗用一抗稀釋濃度均為1 ∶ 1 000)；TBST洗滌后常溫孵育二抗1 h(HRP羊抗兔1 ∶ 1 000)；TBST洗滌后ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光，每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 粉防己堿降低HCT116細胞活力

CCK-8實驗結果顯示，細胞存活率隨粉防己堿處理濃度的增加而降低, 粉防己堿對HCT116細胞抑制效應呈現(xiàn)劑量-效應關系。見圖1。其在HCT116細胞24 h的IC50為9.441 μmol/L，故后續(xù)實驗以二甲基亞砜為對照，分別檢測2.5、5、10 μmol/L粉防己堿對細胞生物功能的影響。

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

2.2 粉防己堿抑制HCT116細胞增殖

細胞集落形成實驗結果顯示，細胞集落數(shù)隨粉防己堿處理濃度增加而減少，與0 μmol/L組相比，2.5、5和10 μmol/L粉防己堿處理組形成集落數(shù)明顯減少(t=9.134，13.51，16.64，P均<0.05)。流式細胞儀分析結果顯示，與0 μmol/L組相比，5 μmol/L和10 μmol/L 粉防己堿處理組G0/G1期細胞比例明顯增加(t=10.06，21.49，P均<0.05)，而S期(t=7.212，21.54，P均<0.05)和G2/M期(t=12.39，25.26，P均<0.05)細胞比例明顯下降。見圖2。

2.3 粉防己堿誘導HCT116細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，與0 μmol/L組相比，5和10 μmol/L粉防己堿處理組細胞凋亡比率增加(t=2.969，23.96，P均<0.05)。見圖3。熒光染色檢測細胞早期凋亡結果顯示，線粒體膜電位熒光強度隨粉防己堿處理濃度增加而增強。Hoechst 33342細胞核染色結果顯示，粉防己堿處理組細胞核熒光增強，標志著粉防己堿處理組細胞早期凋亡增多。見圖4。

2.4 粉防己堿抑制HCT116細胞遷移

遷移實驗結果顯示，與0 μmol/L組相比，2.5、5、10 μmol/L粉防己堿處理組遷移至下室的細胞數(shù)目明顯減少(t=9.057，18.69，19.35，P均<0.05)。見圖5。劃痕實驗結果顯示，粉防己堿對HCT116細胞遷移抑制呈現(xiàn)劑量-時間-效應關系，與0 μmol/L組相比，5和10 μmol/L粉防己堿處理組細胞48 h劃痕修復率明顯降低(t=4.187，5.260，P均<0.05)，2.5、5、10 μmol/L粉防己堿處理細胞72 h劃痕修復率降低(t=5.182，6.376，8.329，P均<0.05)。見圖5。

2.5 粉防己堿可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路逆轉細胞上皮間質轉化

顯微鏡下觀察顯示，與0 μmol/L組相比，經(jīng)10 μmol/L粉防己堿處理的HCT116細胞多呈圓形，有更多上皮細胞形態(tài)，而未經(jīng)加藥處理的細胞多呈梭形間充質形態(tài)。見圖6。蛋白印跡結果顯示，與0 μmol/L組相比，2.5、5和10 μmol/L粉防己堿處理組細胞上皮間質轉換(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)標志蛋白表達水平改變：上皮標志物E-鈣黏蛋白表達明顯增加(P均<0.05)，而間充質標志蛋白N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達明顯減少(P均<0.05)。見圖7。進一步檢測PI3K/AKT/NF-κB通路中關鍵蛋白的表達水平，結果顯示，與0 μmol/L組相比，2.5、5、10 μmol/L粉防己堿處理組細胞通路中關鍵分子p-AKT(t=22.89，34.88，23.58，P均<0.05)和p-NF-κB(t=24.30，26.12，28.89，P均<0.05)表達水平均明顯降低，表明其活化受到抑制。見圖8。

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較A：細胞克隆形成實驗結果；B：流式細胞儀檢測細胞周期實驗結果

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

A：線粒體膜電位檢測結果(100×，50 μm)；B：Hoechst 33342細胞核染色結果(100×,50 μm)

A：遷移實驗結果(100×)；B：劃痕實驗結果(100×)；*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

圖6 粉防己堿對HCT116細胞形態(tài)的影響(100×)

3 討論

既往研究表明，粉防己堿可通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡來發(fā)揮抗癌活性，如其通過Bcl-2/Caspase3/PARP途徑使結直腸癌HT29細胞株阻滯于G1/S期，進而誘導腫瘤細胞凋亡[12]；也有研究發(fā)現(xiàn)其通過上調TGF-β1來抑制PTEN磷酸化，從而抑制結直腸癌細胞增殖[13]。本研究結果顯示，粉防己堿能抑制人結直腸癌HCT116細胞增殖，使細胞停滯于G0/G1期，誘導細胞凋亡。腫瘤細胞不受抑制的增殖常伴有細胞周期失調[14]。由此說明粉防己堿可能通過阻滯細胞周期，進而抑制腫瘤細胞增長和誘導細胞凋亡。但粉防己堿是否影響結直腸癌HCT116細胞株其他生物學行為，如遷移、EMT、腫瘤相關信號轉導通路的激活等還需要進一步研究。

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

*：P<0.05，與0 μmol/L組比較

細胞遷移是惡性腫瘤細胞轉移的重要步驟，抑制腫瘤細胞遷移是防止惡性腫瘤細胞轉移的前提和基礎。本研究結果顯示，小于IC50的粉防己堿能顯著抑制HCT116細胞遷移。多項研究證實，EMT與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、抗凋亡等多項惡性表型相關[15]。EMT是指上皮細胞在一些因素作用下，失去細胞極性，丟失細胞間緊密連接和黏附連接，轉變成具有間質細胞形態(tài)和特性的細胞；不適當?shù)腅MT參與促進腫瘤細胞浸潤轉移，使腫瘤細胞逃逸某些因素誘導的凋亡,獲得腫瘤干細胞樣特性[15-16]。HCT116細胞多呈梭形間充質形態(tài)，以侵襲遷移為特征，有著EMT標志性變化[11]。本研究結果顯示，小于IC50的粉防己堿能上調HCT116細胞上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達，同時下調間充質性標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達。由此提示，粉防己堿可能通過逆轉HCT116細胞EMT，進而降低細胞遷移能力。

研究表明，PI3K/AKT信號通路廣泛參與調節(jié)腫瘤細胞多項生物學行為，在促進和維持腫瘤惡性表型方面起關鍵作用[17]。為進一步探究粉防己堿影響HCT116細胞生物功能的分子機制，本實驗利用蛋白印跡技術檢測小于IC50的粉防己堿對細胞PI3K/AKT信號通路中關鍵分子表達水平的影響，結果顯示，該通路中關鍵分子p-AKT活化明顯受到抑制。研究證實，NF-κB是活化的AKT重要的下游靶點之一，參與調控多種生物進程，如姜黃素通過抑制NF-κB信號逆轉乳腺癌細胞EMT,抑制腫瘤細胞轉移[18]；烏苯美司通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的激活，抑制胃癌細胞增殖[19]。本研究結果顯示，粉防己堿能下調HCT116細胞中p-NF-κB表達水平，由此推測粉防己堿可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路抑制腫瘤細胞的惡性表型，但其影響腫瘤細胞生物功能的具體分子靶點仍需進一步探索。

綜上，本實驗證明粉防己堿可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB 信號途徑，逆轉HCT116細胞EMT，進而降低細胞增殖遷移能力，誘導細胞凋亡。