腹部推拿對便秘型腸易激綜合征家兔ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)的影響?

駱雄飛，趙 娜，劉斯文，李華南，張 瑋，王強(qiáng)松，王金貴△

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193； 2. 國家中醫(yī)藥管理局推拿手法生物效應(yīng)三級實(shí)驗室，天津 300193； 3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常見的消化系統(tǒng)疾病，屬于功能性胃腸病范疇，以持續(xù)或間歇發(fā)作的腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和大便形狀異常為臨床表現(xiàn)。IBS影響全球5%～20%人的生活[1]，降低患者的生活質(zhì)量[2]，其程度不亞于糖尿病、肝硬化、腎功能不全，故而日益受到關(guān)注。由于IBS發(fā)病機(jī)理的復(fù)雜和多元性，目前尚無特異性治療方法。而傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的推拿療法在治療IBS方面積累了豐富的經(jīng)驗，對于各亞型IBS具有獨(dú)特療效。

腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal, ICC)-胃腸平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell,SMC)網(wǎng)絡(luò)是目前腸動力研究的熱點(diǎn)，ICC與腸神經(jīng)及臨近肌細(xì)胞間通過特殊的縫隙連接，形成ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)。ENS擔(dān)負(fù)著胃腸道的神經(jīng)反射和控制活動，調(diào)節(jié)腸道動力；ICC在神經(jīng)肌肉信號傳遞中起調(diào)節(jié)作用，與胃腸道蠕動功能密切相關(guān)；SMC是調(diào)控腸動力的關(guān)鍵性因素之一。腸動力的完成離不開ENS、ICC和SMC三者的共同協(xié)作，其中任一部分發(fā)生病變必將導(dǎo)致腸動力功能紊亂。本課題組以便秘型IBS家兔為研究對象，以ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)為切入點(diǎn)，探討腹部推拿調(diào)節(jié)便秘型IBS腸動力的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物 選用2月齡家兔50只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由天津裕達(dá)實(shí)驗動物養(yǎng)殖有限公司提供(合格證號SCXK津2016-0001)。

1.1.2 主要試劑 Anti-C-kit antibody(Abcam,英國，批號ab5506)；Anti-nNOS antibody(Abcam,批號ab2801，英國)；Fura-2/AM(sigma美國)；Pluronic-F127(sigma美國)；溴化乙錠(Ethidium Bromide,北京鼎國)；正常熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠(GIBCO,美國)；低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠(GIBCO,美國)；無水乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；二甲苯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)；蘇木素染液(上海碧云天)。

1.1.3 主要儀器 EGEG-8D型八導(dǎo)智能胃腸電圖儀(合肥凱利光電科技有限公司)；5415D型離心機(jī)(Eppendorf,德國)；PTC-200型熱循環(huán)儀(Bio-Rad,美國)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS,日本)；TS-1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；干燥消毒烤箱(DHG-9246A,上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；水浴恒溫箱(DK-8,上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；組織切片機(jī)(ST-10,北京世聯(lián)博研科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 采用隨機(jī)、對照研究方法，按照計算機(jī)隨機(jī)數(shù)字表法將家兔分為空白對照組10只，模型對照組20只，腹部推拿組20只，采取冰水灌胃應(yīng)激法造模[3]。模型對照組、腹部推拿組家兔分籠獨(dú)立飼養(yǎng)，消除生物節(jié)律影響，每日晨8時冰水灌胃(0～4 ℃生理鹽水，20 ml/只/d，14 d)，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。

1.2.2 干預(yù)方法 腹部推拿組：研究者掌指關(guān)節(jié)自然伸直，四指并攏，以食指中指羅紋面接觸實(shí)驗家兔腹部關(guān)元和氣海穴。以肘關(guān)節(jié)帶動前臂做環(huán)形運(yùn)動，以研究者食指中指面著力于實(shí)驗家兔腹部做順時針揉動，頻率30圈/min，操作5 min。造模結(jié)束后開始，每日治療1次，連續(xù)治療14 d。模型對照組：每日仰臥捆綁實(shí)驗家兔1次10 min，不給予腹部推拿，連續(xù)14 d；空白對照組：不給予任何干預(yù)。

1.2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法 排便情況：自造模開始，每日收集空白對照組、模型對照組、腹部推拿組家兔糞便，固定托盤收集后150 ℃烘干1.5 h，電子秤稱重烘干前后質(zhì)量，根據(jù)公式(烘干前-烘干后)/烘干前=含水率%，計算出每只家兔糞便含水率。驗證造模成功及干預(yù)效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)為糞便含水率呈趨勢變化。胃及結(jié)腸肌電檢測：在實(shí)驗兔的胃與結(jié)腸體表投影處及左前肢腕關(guān)節(jié)上0.5 cm(放置參考電極)剪毛，用950 ml/L乙醇脫脂，將8個直徑0.7 cm的Ag2agcl圓盤電極用9.0 g/L氯化鈉注射液棉球覆蓋，電極放置順序。胃電：胃底-胃小彎-胃大彎-幽門；腸電：升結(jié)腸-橫結(jié)腸-降結(jié)腸-直腸，膠布固定，用胃腸電圖儀記錄10 min腸電圖，以1 min為一個時間段，分別計算每個時間的頻率(單位：Hz)和振幅(單位：mv)，記錄觀察結(jié)腸電信號變化；結(jié)腸傳輸功能檢測：制備殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球[4]，制備異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記殼聚糖。實(shí)驗前禁食24 h，自由飲水；FITC標(biāo)記微球用蒸餾水分散均勻，各實(shí)驗組按照50 mg/kg體質(zhì)量給家兔灌胃，灌胃后分別在不同時間點(diǎn)(16、24 h)取胃、小腸、結(jié)腸三部分，使用小動物成像儀觀察FITC標(biāo)記交聯(lián)微球在家兔胃腸道的分布情況；ENS-ICC結(jié)構(gòu)觀察：迅速取出結(jié)腸組織，將組織剖開去除內(nèi)容物，在解剖顯微鏡下用顯微解剖鑷將黏膜層和黏膜下層作為一層剝除，保留完整肌層制備石蠟切片。脫蠟后做C-Kit/nNOS免疫熒光雙重標(biāo)記，封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察圖像；電鏡觀察ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)，迅速用冷刀片取結(jié)腸組織，長度為1 cm。沿系膜緣剖開，用冰鹽水漂洗去除內(nèi)容物，立即放入2.5%冷戊二醛溶液，放入4 ℃冰箱固定24 h。用0.2MPBS漂洗4次，每次15 min，再用l%0s04固定1.5 h，用0.2MPBS漂洗15 min。梯度丙酮50%、70%、90%、100%中脫水各4次，每次15 min；100%丙酮：環(huán)氧樹脂(1∶1)1 h，然后100%丙酮：環(huán)氧樹脂(1∶2)2 h，再純樹脂3 h以上。先滴1滴環(huán)氧樹脂至塑料膠囊，再將樣品挑入囊底插入標(biāo)簽，灌滿環(huán)氧樹脂，用針尖調(diào)整樣品至合適位置，放入恒溫箱(60 ℃)聚合12 h。半薄切片(厚1.0～2.0 μm)，2%甲苯胺藍(lán)染色，在光鏡下觀察、確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層。選定區(qū)域修塊進(jìn)行超薄切片，超薄切片厚50～70 nm，400目銅柵網(wǎng)撈片。2%醋酸鈾染色15 min，檸檬酸鉛染色5 min，晾干。透射電鏡觀測比較各組ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)變化并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔糞便含水率影響

圖1示，模型對照組家兔糞便含水率呈逐漸降低趨勢并低于空白對照組，腹部推拿干預(yù)后，糞便含水率有恢復(fù)趨勢。

圖1 各組家兔糞便含水率變化比較

2.2 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔胃腸電活動的影響

表1示，相對于模型對照組，腹部推拿組胃電活動平均幅值有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；相對于模型對照組，腹部推拿組腸電活動平均幅值與平均頻率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明腹部推拿可以有效刺激腸蠕動，增強(qiáng)腸電活動幅值和頻率，改善腸動力障礙兔的腸電活動損傷。另外，腹部推拿組腸電幅值和頻率高于空白對照組，可能與腹部推拿的即時效應(yīng)有關(guān)。

表1 各組家兔胃腸電活動變化比較

注：a.空白對照組；b.模型對照組；c.腹部推拿組圖2 小動物成像系統(tǒng)觀察各組家兔不同時間消化道內(nèi)胃、小腸、結(jié)腸內(nèi)FITC標(biāo)記微球分布情況

2.3 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔消化道內(nèi)FITC標(biāo)記微球分布的影響

圖2示，分別測定家兔插管灌胃后16 h和24 h后在胃腸道的分布情況。在家兔插管灌胃16 h后，空白對照組家兔FITC標(biāo)記微球主要分布在小腸，結(jié)腸有很少熒光強(qiáng)度的微球；而模型對照組主要分布在胃部，小腸和結(jié)腸有很少熒光強(qiáng)度，而腹部推拿組家兔結(jié)腸熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。24 h后熒光強(qiáng)度示，空白對照組結(jié)腸部位有一定強(qiáng)度的熒光，胃部熒光較少，模型對照組胃部有少量熒光，小腸和結(jié)腸有一定強(qiáng)度的熒光；而腹部推拿后家兔結(jié)腸熒光明顯增強(qiáng)，與16 h結(jié)果相似。

2.4 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔ENS-ICC結(jié)構(gòu)中C-Kit和nNOS表達(dá)的影響

圖3示，相對于空白對照組，模型對照組C-Kit和nNOS的表達(dá)明顯減少且形態(tài)不明顯；經(jīng)腹部推拿后，C-Kit和nNOS的表達(dá)明顯增加且形態(tài)明顯。

注：a.空白對照組；b.模型對照組；c.腹部推拿組圖3 免疫熒光染色觀察各組家兔結(jié)腸組織中ENS-ICC結(jié)構(gòu)中C-Kit和nNOS表達(dá)

2.5 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)的影響

圖4示，空白對照組ICC細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，呈長梭狀，核膜完整，胞質(zhì)中有大量線粒體。SMC形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核膜完整，能看到豐富的細(xì)胞器，如線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。相鄰ICC之間連接緊密，ICC與周圍SMC形成緊密的縫隙連接。而模型對照組ICC細(xì)胞形態(tài)較模糊，有一個長突起，胞質(zhì)較少，SMC核體較小，核膜尚完整，可見有腫脹的線粒體，與周圍細(xì)胞連接松散，ICC與周圍SMC之間連接松散，未見有縫隙樣連接。經(jīng)腹部推拿干預(yù)后，ICC細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，呈長梭狀，核膜完整，胞質(zhì)中能看到線粒體。SMC形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核膜完整。ICC與周圍SMC形成緊密的縫隙連接，與鄰近神經(jīng)纖維末梢形成突觸樣連接，ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)完整。

注：a.空白對照組；b.模型對照組；c.腹部推拿組圖4 投射掃描電鏡分析各組家兔結(jié)腸組織中ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)比較

3 討論

IBS因其臨床癥狀復(fù)雜，潛在發(fā)病機(jī)制尚不明確，當(dāng)前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其臨床治療乏善可陳，尚無治愈該病的手段，改善癥狀的藥物和非藥物治療方案的臨床療效亦有待確定。目前對于該病的病理研究表明，其發(fā)病與ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)有密切關(guān)系。

ENS作為胃腸道內(nèi)由興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元組成的神經(jīng)節(jié)，其神經(jīng)元與神經(jīng)纖維的數(shù)量、形態(tài)是維系胃腸道調(diào)節(jié)功能正常的基礎(chǔ)。ENS損傷、變性、缺失會引起腸道運(yùn)動、分泌功能異常[5]。同時ENS與作為腸道起搏細(xì)胞的ICC緊密伴隨，對胃腸功能進(jìn)行局部調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)腸道動力的重要因素[6]。ICC作為一種非神經(jīng)細(xì)胞，大量研究證實(shí)ICC數(shù)量和形態(tài)異常對動力障礙性疾病(如胃排空異常、慢傳輸型便秘、Oddi括約肌功能障礙和其他胃腸動力障礙相關(guān)疾病)有很大影響[7]，同時與神經(jīng)活動有著特殊的連帶關(guān)系。其通過調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉信號傳遞，改變胃腸道的蠕動功能。SMC作為調(diào)控腸動力的另一關(guān)鍵性因素，其發(fā)揮作用主要由離子通道的激活來控制平滑肌細(xì)胞收縮等許多生理過程。

腸動力的正常運(yùn)轉(zhuǎn)離不開ENS、ICC和SMC三者構(gòu)成的ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、介導(dǎo)、傳遞等一系列反應(yīng)，最后產(chǎn)生結(jié)腸蠕動的機(jī)械效應(yīng)。因此，ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)中發(fā)生病變或破壞將導(dǎo)致腸動力功能紊亂。

推拿手法直接作用于人體，以力為作用特征。在手法作用力下，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)換和生物電等信息傳導(dǎo)，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)。已證實(shí)外界機(jī)械力可以引起細(xì)胞生物力學(xué)環(huán)境改變，產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力可改變細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，同時還能調(diào)控細(xì)胞的功能狀態(tài)，影響細(xì)胞的增殖、分化[8-10]。當(dāng)手法作用于腹部時，力以機(jī)械波的形式傳入細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的效應(yīng)部位(如核糖體、線粒體)轉(zhuǎn)變?yōu)樯镄?yīng)，其作用可引起細(xì)胞形貌的改變；機(jī)械力信號也可能轉(zhuǎn)變成生物信號的過程引起細(xì)胞的生化和生理應(yīng)答[11]，可能影響ICC、腸神經(jīng)元、腸平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。

本研究綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、透射電鏡等現(xiàn)代多學(xué)科的研究技術(shù)，對腸動力障礙兔結(jié)腸組織中ENS變化及ICC和SMC網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)觀察分析，說明腹部推拿可干預(yù)消化道動力產(chǎn)生與調(diào)節(jié)的基本功能單位，其調(diào)節(jié)IBS胃腸動力障礙的作用可能與其對腸ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)，在一定程度上揭示其防治腸動力障礙性胃腸病的作用機(jī)制。

中醫(yī)認(rèn)為腹部居人體之中，為上下聯(lián)結(jié)的樞紐。《厘正按摩要術(shù)》曰：“胸腹者，五臟六腑之宮城，陰陽氣血之發(fā)源，若欲知其臟腑何如，則莫如診胸腹。[12]”五臟六腑尤以脾胃在腹部推拿中具有重要的地位，這與其所處的位置和生理作用密切相關(guān)，也是腹部推拿治療消化系統(tǒng)疾病的原理所在。盡管從中醫(yī)角度采用腹部推拿治療臟腑疾病，尤其是腸動力障礙引發(fā)的功能性胃腸病具備一定理論基礎(chǔ)，但其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)作用機(jī)制的研究尚處于初級階段且尚未明確。因此，進(jìn)一步闡明腹部推拿治療腸動力障礙引起的功能性胃腸病的作用機(jī)制，有助于提高其臨床應(yīng)用水平，對于深化腹部推拿基礎(chǔ)研究、促進(jìn)推拿學(xué)科發(fā)展具有重要意義。