siRNA介導(dǎo)的ADAM17基因沉默對前列癌PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李 雪，馮樹強(qiáng)，李然偉，田文杰，姜 爽，楊 賀

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長春130041)

據(jù)流行病學(xué)資料統(tǒng)計，前列腺癌(prostate cancer,PCa)是危及男性健康的主要疾病，尤其是西方國家男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌[1]。近年來隨著人口老齡化到來和高齡人群增多，我國PCa的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升趨勢[2]。早期腫瘤可以通過外科手術(shù)、放射治療達(dá)到臨床治愈，但晚期腫瘤則需要采用激素治療。去勢治療雖然有效，然而絕大多數(shù)患者在治療過程中因轉(zhuǎn)歸為雄激素非依賴性而最終需要化療，但副作用大且療效差[3]。因此人們開始探索新的分子靶向用藥的基因治療。隨者研究的深入，發(fā)現(xiàn)ADAM17的異常表達(dá)與PCa細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)功能和效應(yīng)密切相關(guān)，在PCa的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的全過程中扮演著極其重要的角色，也發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用[4，5]。鑒子RNA干擾技木被普遍認(rèn)為能從源頭上使某些致癌基因“沉默”，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。故我們應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，設(shè)計針對ADAM17-siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后觀察ADAM17在PCa中表達(dá)的變化，并探討其變化對PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在為提高臨床PCa的治療水平提供實驗依據(jù)和新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料人前列腺癌PC3細(xì)胞株購自ATCC公司， PGCsi-U6/Neo/GFP購于上海吉凱基因化學(xué)公司，Trizol試劑為 Gibco公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶和工具酶購于大連 Takara公司，RPMI1640培養(yǎng)基,，小牛血清為Hgclone公司產(chǎn)品，轉(zhuǎn)染試劑 LipofetamineTM2000購于 Invitrogen公司，G418購于 Sigma公司，ADAM17定量檢測試劑盒購于晶美公司，流式細(xì)胞儀(FCM)購自美國Clomech公司， 噻唑藍(lán)(MTT)購自上海吉凱基因化學(xué)公司，原位未端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京中山生物公司。

1.2 實驗方法

①shRNA設(shè)計和質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)shRNA設(shè)計原理，設(shè)計針對ADAM17 siRNA表達(dá)質(zhì)粒,，另設(shè)計一個不含持異性的ADAM17序列的PGC-CONT作為對照(以下稱陰性對照組)。序列編號為：ADAM17意義鏈5′-GATCCAATGGATGTCTATCA-

TTCAAGAGATGATAGACATCCATGAACTTT-

TTTTGGAAA；反義鏈5′-AGCTTTTCCAAAAA-

AAGTTCATGGATGTCTATCATCTCTTGAAT-

GATAGACATCCATGAACTG。

PGC-CONT意義鏈

5′-GATCCAATGGATGTCTATCATTCAAGAG-

ATGATAGACATCCATGAAC TTTTTTTGGA-

AA；反義鏈5′-AGCTTTTCCAAAAAAAGTTCATGGATGTCTATCATCTCTTGAATGATA-

GACATCCATGAACTG。

將互補的意義鏈和反義鏈分別引入HamhI和HindⅢ酶切位點，每對單鏈寡核苷酸片段等量混勻，91℃變性6 min后，75℃退火12 min實時與HamhI和HindⅢ雙酶切線的PGCsi-U6/Neo/GFP質(zhì)粒鏈接，連接產(chǎn)物分別命名為 PGC-si ADAM17，PGC-CONT。連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測序正確后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞。

②PC3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：PC3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的不含抗生素的RPM1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，按 Lipofetaminetm2000使用說明書要求程序轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在500 mg/L的G418壓力下篩選陽性克隆。

③RT-PCR檢測PC3細(xì)胞ADAM17的表達(dá)；提取PC3細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增ADAM17片段，以β- cactin作為內(nèi)參。ADAM17引物:上游引物5′- CAGAAGGAG GAGGGCAGAAT-3′，下游引物5′- TGGCCTT GGTGAGGTTTGAT-3′，擴(kuò)增片段256 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊芝糖凝膠電泳分離，于紫外燈下拍照。

④MTT法檢測PC3細(xì)胞增殖率：取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組3復(fù)孔，每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個，37℃培養(yǎng)48 h后變換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔分別加入MTT20 μI，37℃孵育4 h，輕輕吸去上清，加入100 ul DMS0，37℃振蕩降解25 min后，檢測A590值，結(jié)果取3孔平均值。

⑤TUNEL法測定PC3細(xì)胞凋亡率：在胰酶消化后的各組細(xì)胞懸液中滴加 TUNEL反應(yīng)液37℃濕盒卵育2 h，PBS洗滌3次，滴加過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體37℃濕盒卵育25 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替 TUNEL反應(yīng)液作為陰性對照。陽性對照切片經(jīng)DNA酶I預(yù)處理8 min后按 TUNEL法步驟進(jìn)行染色。結(jié)果判定：凋亡細(xì)胞的胞核呈棕黃色，每張切片觀察5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算凋亡細(xì)胞所占的百分率(凋亡率)。

⑥FCM檢測PC3細(xì)胞周期變化：分別收集上述3組細(xì)胞，每組1×106個，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，冰PBS洗滌3次后逐滴緩慢加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇中，4℃固定36 h，PBS洗滌去除固定液，加入核糖核苷酸A重懸細(xì)胞，避光染色3 h。FCM檢測各組PC3細(xì)胞的周期分布清況。實驗重復(fù)3次，用MPIAS-500多媒體彩色病理圖文分折系統(tǒng)對陽性細(xì)胞著色的平均灰度進(jìn)行定量分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGC-si ADAM17表達(dá)載體的鑒定及篩選對2個重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果與所設(shè)計的ADAM17 siRNA寡核苷酸序列一致，證明PGC-siADAM17及PGC-CONT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，35 d后獲得陽性細(xì)胞克隆。

2.2 ADAM17-siRNA對PC3細(xì)胞ADAM17表達(dá)的影響各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ADAM17 mRNA表達(dá)結(jié)果如圖1所示，A圖為RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，B圖為所得的比值。與未轉(zhuǎn)染組比較:載體組的ADAM17 mRNA表達(dá)水平下調(diào)。這表明ADAM17 siRNA抑制了PC3細(xì)胞ADAM17的表達(dá)，發(fā)揮了特異的RNAi作用。

2.3 MTT法檢測結(jié)果若將未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖設(shè)定為100%，則PGC-CONT及PGC-si ADAM17增殖率分別為91.7%和53.6%，與空質(zhì)粒PGC-CONT的陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞ADAM17的RT-PCR結(jié)果

A:RT-PCR電泳圖(M:marker;1:載體轉(zhuǎn)染組；2：陰性對照組；3：未轉(zhuǎn)染組 B:光密度掃描ADAM17/β-actin表達(dá)水平比值

*與陰性對照組相比，P<0.01

A(590 mm)

2.4 FCM測定結(jié)果未轉(zhuǎn)染組，陰性對照組和ADAM17 siRNA組G0/G1期細(xì)胞所占的比例分別為46.9±0.9%、48.5±1.5% 和59.8±1.4%，與對照比較，ADAM17siRNA組中G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯增加，S期細(xì)胞顯著減少(P<0.05,表1)。

2.5 TUNEL法檢測結(jié)果未轉(zhuǎn)染組，陰性對照組和載體轉(zhuǎn)染組的瘤細(xì)胞凋亡率分別為1.3%、2.8%和12.7%，組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

表1 FCM檢測瘤細(xì)胞G0/G1期和S期細(xì)胞比例

圖3 TUNEL法檢測瘤細(xì)胞凋亡率

3 討論

PCa是一個多因素、多壞節(jié)、多階段的復(fù)雜疾病，RNAi技術(shù)本身則可以針對多個基因或者基因族的共有序列來抑制多個基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、抑制腫瘤生長[7]。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，針對ADAM17設(shè)計了ADAM17 siRNA表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在體外對前列腺癌PC3細(xì)胞具有抑制生長并促進(jìn)凋亡的作用。到目前為止的研究普遍認(rèn)為，ADAM17 在包括PCa在內(nèi)的人體多種惡性腫瘤中表達(dá)陽性，尤其在PCa中高表達(dá)，其表達(dá)水平不但與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且還和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及患者的生存期縮短有關(guān)，是一個預(yù)后不良和術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險高的指標(biāo)，它已成為目前研究的熱點癌基因[8.9]。本實驗通過ADAM17 siRNA沉默ADAM17達(dá)到了較好的抑制前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的效果。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，PGC-siADAM17的載體轉(zhuǎn)染組對癌細(xì)胞抑制率為53.6%，凋亡率為12.7%，而且是癌細(xì)胞大多停滯在GO/GI期，不能向成熟癌細(xì)胞遷移、分化。這是我們初步認(rèn)為以RNA于擾為基礎(chǔ)的靶向ADAM17的基因治療極有可能是提高前列腺癌療效的新的有效方法之一。但由于令人鼓舞的本研究成果只是在單細(xì)胞水平上取得的，因而其更確切的實用臨床意義還有待動物實驗和臨床試驗的進(jìn)一步驗證，本課題組成員將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更深入的后續(xù)研究。希望通過對ADAM17的研究，能夠為明確和厘清腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制帶來一定幫助，從而提高前列腺癌患者的臨床療效和治療水平。