液相色譜-質譜聯用技術篩查synemin蛋白及其在腎癌診斷中的作用

譚文佳，楊照微，劉金華，孫志霞*

(吉林大學中日聯誼醫院 1.超聲科;2.檢驗科，吉林 長春130033)

腎癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤，發病率逐年增加[1,2]。synemin(SYNM)是Ⅳ型中間絲蛋白，具有調節細胞運動、粘附和遷移的功能[3,4]，該蛋白質廣泛表達于哺乳動物的中胚層和外胚層的收縮性細胞[5]。在Ⅳ級星形細胞瘤患者中高表達[6,7]，在肝癌[8]、結直腸癌[9]、乳腺癌[10,11]組織中低表達。

蛋白質組學技術廣泛的應用于化學和醫學領域，尤其是在對癌癥的研究中，對我們進一步了解癌癥的形成和發展具有重大意義[12]。本研究的目的是尋找腎癌組織和癌旁組織的差異蛋白，探索synemin蛋白成為腎癌生物標志物的可能性。利用液相色譜-質譜法鑒定腎癌和癌旁組織差異表達的蛋白，采用免疫組織化學的方法驗證腎癌標本中synemin蛋白的差異表達。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選擇90例TNM Ⅲ期腎透明細胞癌患者。收集樣本包括：術中獲得新鮮的腎癌和配對的癌旁組織。PBS沖洗樣本，液氮中保存。

1.2 試劑與儀器

蛋白質提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、PBS粉劑購自美國賽默飛公司。二甲苯購自北京化工廠。LTQ XL 離子阱質譜儀購自美國賽默飛公司。電泳儀、電泳槽購自柏奧易杰北京科技有限公司。電子天平購自德國Mettler Toledo 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1提取樣品總蛋白、測定蛋白濃度 從樣本庫中隨機選取30例病理明確診斷為TNM Ⅲ期腎透明細胞癌患者的癌組織及癌旁組織標本隨機分組(每組10例，共分為三組)。在實驗條件不變的情況下，對三組樣本進行3次重復實驗。將上述分組的組織樣本取出、剪碎，在液氮環境下研磨勻漿。稱取0.1 g樣本，置1.5 ml離心管。添加1 ml的裂解緩沖液，將混合物在冰浴中充分振蕩、溶解。4 ℃，將離心機設置為12 000 g，離心1 h，分離上清液。分裝樣品，冷凍保存。

1.3.2樣品蛋白水解多肽混合物 50 mM NH4HCO3溶液完全溶解樣品，1M二硫蘇糖醇溶液，使混合液C=20 mM，56 ℃，避光1 h。加入等體積的1 M碘代乙酰胺，使混合液C=50 mM，避光45 min。加入測序級胰酶(胰酶∶蛋白=1∶50)，常溫靜置。

1.3.3二維色譜-質譜聯用技術分離、多肽混合物鑒定 0.1%甲酸溶液完全溶解樣品，制備150 mm×0.32 mm強陽離子交換柱，串聯150 mm×0.17 mm反相柱(30% Buffer B：0.1% FA，99% CAN)，流速2 μL/min，洗脫3 h，分離50 μg標本。乙酸氨洗脫強陽離子交換柱。LTQ XL離子阱質譜儀檢測多肽混合物。

1.3.4生物信息學分析 對于獲得的譜圖進行數據庫檢索，納入檢索的譜圖的標準為離子信號在10個或大于10個，強度等于或超過10個單位；使用的軟件包為Bioworks 3.3.1 SP1，計算方法為SEQUEST算法；數據庫為人蛋白質數據庫3.51。

1.3.5免疫組化SP法染色

按試劑盒說明書進行操作。顯微鏡下觀察synemin蛋白染色情況。按照黃褐、深黃、淡黃、無色，分別判為：3分，2分，1分，0分。按照陽性細胞數>75%、51%-75%、25%-50%、<25%、陰性，分別判為：4分，3分，2分，1分，0分。最終評分將兩者相乘：≤3為低表達，>3為高表達。

1.3.6統計學分析

2 結果

2.1 腎癌和癌旁多肽化合物及差異蛋白的鑒定

根據液相色譜-質譜聯用技術，對比分析腎癌和癌旁組織的差異蛋白，結合豐度和譜圖數差異，結果證實：26個腎癌組織與癌旁組織差異表達的蛋白，18個在腎癌組織中顯著過表達，8個在腎癌組織中顯著低表達(見表1)。

表1 腎癌組織與癌旁組織差異蛋白

2.2 synemin蛋白的串聯質譜鑒定

synemin蛋白部分序列肽段的串聯質譜圖見圖1和圖2。

圖1 synemin蛋白的質譜鑒定：synemin-EALGLEQLR序列肽段的串聯質譜圖

圖2 synemin蛋白的質譜鑒定：synemin-LQEALGAR序列肽段的串聯質譜圖

2.3 synemin蛋白在腎癌組織和癌旁組織的差異表達

通過免疫組化法發現，在胞漿中synemin蛋白表達較為常見。分析本研究中90例腎癌和癌旁組織synemin蛋白的表達，發現synemin蛋白在68.9%(62/90)腎癌組織中高表達，僅在46.7%(42/90)腎癌旁組織中高表達見表2。結果說明：synemin蛋白在腎癌組織中高表達，統計學差異明顯(P<0.05)。

表2 對比腎癌與癌旁組織中synemin蛋白表達

3 討論

蛋白質組學技術廣泛的應用于醫學領域，主要方法包括1H核磁共振(NMR)[13]，氣相色譜-質譜(GC-MS)[14-16]，液相色譜-質譜法(LC-MS)[17-20]。質譜技術和液相色譜技術聯合使用可以分析大分子蛋白[21]。最近研究表明[22,23]，LC-MS能更好地定向選擇性識別低濃度的有機小分子。LC-MS現已廣泛應用于蛋白質的表征和定性定量[24,25]。

本研究首先對臨床樣本進行預處理、檢測樣品總蛋白、測量濃度、二維液相色譜-質譜技術分析腎癌組織及配對的癌旁組織，對質譜數據進行生物信息學分析，發現腎癌和癌旁組織中的多肽混合物，建立了腎癌組織和癌旁組織的差異表達蛋白質譜。然后利用免疫組織化學方法檢查收集的腎癌組織和癌旁組織，發現synemin蛋白絕大部分在胞漿中表達，其在腎癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，說明synemin蛋白在腎癌和癌旁組織中存在差異表達。從而預測synemin蛋白可能成為腎臟惡性腫瘤的生物標志物。