生長抑素受體mRNA在顱咽管瘤中的表達及其意義

楊瑞卿，易 維，陳科潤，錢瑞儀，司馬秀田

(1.四川大學華西臨床醫學院，四川 成都610041；2.四川大學華西醫院 神經外科，四川 成都610041)

顱咽管瘤是顱內的常見腫瘤之一，發病率在我國呈現逐年升高的趨勢，對顱咽管瘤的防治研究是當前的熱點問題之一。正常組織的癌變過程會伴隨著一系列的信號轉導通路的改變，使得癌變組織逃避凋亡以及繼續生長。生長抑素受體(somatostatin receptor，SSTR)是一種G蛋白偶聯受體，在人體各種組織中普遍表達，其中腫瘤細胞中主要表達SSTR2[1]。在不同類型顱咽管瘤組織中檢測SSTR2的表達差異，有助于探討SSTR2在顱咽管細胞癌變發生以及不同類型的轉變關系，為臨床防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組研究對象為顱咽管瘤標本和腦挫裂傷組織標本(對照組)，均來自于2010年6月至2011年2月華西醫院神經外科經接受手術的患者。根據如下納入及排除標準篩選樣本：納入標準：①無家族性疾病病史；②既往無手術史；③手術前無放療、化療史；排除標準：①合并嚴重多器官疾病；②合并身體其他部位的腫瘤；③術后病理切片初篩發現腫瘤組織稀少，大片壞死及血凝塊等雜質過多者。最終收集病例36例，其中男性20例，女性16例。年齡6-62歲，平均29.4歲。釉質上皮型腫瘤(adamantinoma epithelium，AE)21例、鱗形乳頭瘤型(squamous papilloma，SP)15例。對照組標本22例，男性15例，女性7例，年齡為22-47歲，平均32.6歲。所有研究對象均簽署知情同意。手術切除樣本置于無菌凍存管中液氮速凍，后移入-80℃冰箱保存備用。

1.2 定量PCR

1.2.1主要試劑及來源 Trizol購于美國羅氏公司，PCR反應緩沖液購自北京博大泰克公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒購自Fermentas公司，2×SYBR購自Qiagen公司，引物由上海英俊公司合成，定量PCR儀購自德國Eppendorf公司。

1.2.2Trizol 試劑提取總RNA 取組織塊50 mg用液氮在研缽中研磨成粉末,移入玻璃勻漿器加入1 ml Trizol 抽打勻漿,RNA提取方法按照試劑盒說明書進行。采用紫外分光光度計測定提取的RNA在260 nm/280 nm處的吸光度值，純度在1.9-2.1者為合格樣品，進入后續逆轉錄反應。

1.2.3逆轉錄合成cDNA 取1 000 ng RNA,逆轉錄合成cDNA第一條鏈：按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明合成。cDNA置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.4SSTR2 mRNA的相對表達量檢測 以cDNA作為模板，β-actin作為內參照， DEPC水作為陰性對照，對SSTR2 mRNA進行相對定量。SSTR2引物：SSTR2上游：5′-TGCTGGGTCTGCCTTTCTTGG-3′；下游：5′-AGAAGATGCTGGTGAACTGATTGATG-3′。β-actin引物：上游：5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′；下游：5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′。定量PCR反應體系：2×SYBR 10 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl ，DEPC水補足20 μl。PCR反應條件：①94℃預變性2 min②94℃變性15 sec③60℃退火30 sec④72℃延伸30 sec⑤擴增40循環次數⑥72℃延伸加時10 min⑦4℃保存。以2-ΔΔCt值進行相對定量。

1.3 數據處理

2 結果

2.1 顱咽管瘤影像學資料

顱咽管瘤代表性核磁共振資料見圖1，圖中顯示，腫瘤起源于鞍上，腫瘤有不均一強化，囊變，累及下丘腦進入三腦室內，接近中腦。

圖1 顱咽管瘤典型影像學表現

2.2 定量PCR檢測SSTR2基因在顱咽管瘤組織中的表達

定量PCR結果顯示：顱咽管瘤組織和對照組織中SSTR2 mRNA的相對含量分別為0.642和0.242，與對照組相比，SSTR2 mRNA的相對含量明顯增強，差異具有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 顱咽管瘤和對照組SSTR2 mRNA相對表達量

aP<0.05，vs control

2.3 SSTR2mRNA在不同顱咽管瘤病理類型中的表達

SSTR2基因在顱咽管瘤兩種不同病理類型(AE和SP)中的相對表達量見表2。結果顯示：AE類型SSTR2基因表達明顯強于SP，其相對含量分別為0.811量分別為表同和0.467量分別為表同，二者比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 SSTR2 mRNA在不同顱咽管瘤病理類型中的表達

aP<0.05，vs control

3 討論

顱咽管正常細胞的癌變過程包含多種信號傳導通路的改變，特別是G蛋白耦連信號傳導通路的改變，進而引起細胞生物學效應的改變，包括原癌基因的活化和抑癌基因的失活等，因此從信號傳導通路方面抑制癌變的發生具有非常重要的臨床意義。生長抑素作為一種由體內多種組織產生分泌并且廣泛存在的激素，其主要作用抑制垂體生長激素和胃泌素的分泌，也可作為一種神經遞質，在人體內起著重要的調節作用，其主要的受體是SSTR[2]。SSTR作為G蛋白耦連信號轉導通路的受體，在細胞內外信號傳遞轉換過程中起著不可或缺的作用，既可以通過抑制腺苷酸環化酶-cAMP途徑，進而使cAMP的水平降低，從而阻止原癌基因的激活，抑制細胞的增殖，也可以通過MAPK途徑使酪氨酸激酶失活，從而阻止細胞的增殖[3]。

本研究運用定量PCR檢測顱咽管瘤中SSTR2基因的表達，結果顯示顱咽管瘤組織中SSTR2基因表達明顯增強，提示生長抑素及其類似物可能對抑制顱咽管瘤細胞的增殖具有顯著的效果，奧曲肽等生長抑素類似物藥物可能具有不錯的療效，但奧曲肽的治療需要大劑量服用，且長期服用可能具有副作用，產生耐藥性[4]。本實驗中，結果也顯示釉質上皮型(AE)的SSTR2基因表達明顯強于鱗形乳頭瘤型(SP)，對于AE型顱咽管瘤的奧曲肽等生長抑素類似物的治療效果可能優于SP型，但是也不可忽略生長抑素類似物對于SP型顱咽管腫瘤的治療作用。如果奧曲肽的治療效果未達到預期的療效，可采用生長激素抑制物結合奧曲肽的治療[4]。有研究表明，過表達SSTR2可以對內源性SSTR2表達陽性和陰性的腫瘤具有顯著的抑制效果，亦可以考慮SSTR2的轉基因治療[5]。國外之前報道，SSTR與表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)常常在細胞上呈現負相關[6]，EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，能夠刺激細胞的增殖。因此對于腫瘤的治療，不僅僅只是通過激活SSTR來抑制細胞的增殖，也需要通過提高SSTR的水平來降低EGFR的濃度，從而抵消EGFR的作用。因此對于較低表達SSTR2的SP型顱咽管瘤，可以通過提高SSTR水平的藥物或SSTR的轉基因來治療。

此外，有研究顯示，采用原子量為177的放射性元素镥(Lu)在螯合劑DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四羧酸)的作用下與酪氨酸(Tyr)-奧曲肽相偶聯,在合適劑量的情況下，這種通過生長抑素受體介導的放射治療可以產生不錯的抗腫瘤效果，并且對正常組織不會產生較大的毒害作用[7]。而在本實驗中，顱咽管瘤的SSTR2水平顯著高于對照組織，對該種螯合治療劑敏感，可能只需較小的劑量便可獲得意想不到的療效，并且也不會像通常的放射性治療一樣對身體造成很大的傷害，有望成為臨床上治療顱咽管瘤的一種新方法。