BDNF過表達的人臍帶間充質干細胞源性多巴胺能樣神經元的構建和鑒定

蔣芝 徐君 馮美江

PD是一種與年齡相關的神經退行性疾病，以運動遲緩、靜止性震顫、姿勢平衡障礙和肌強直等癥狀為主要臨床表現。PD的具體病因及發病機制尚未明確，目前的治療方式只能改善臨床癥狀，并不能逆轉PD的病情進展。近年來，干細胞移植治療PD引起了人們的關注。人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymalstemcell，HUC-MSCs）來源于新生兒的臍帶組織，具有來源廣泛、免疫源性低、取材無創性、無倫理問題、不受供體年齡因素影響等優勢，成為干細胞移植治療PD的理想種子細胞［1］。研究證明，HUC-MSCs能被誘導分化為多巴胺能樣神經元，移植治療PD大鼠模型后能改善其行為學癥狀［2-3］。腦源性神經營養因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）是神經營養因子家族中的一員，可促進干細胞向神經元的分化、成熟［4］，并提高移植的細胞在PD模型動物腦內的存活能力［5］。據一項meta分析顯示，PD病人血清中BDNF水平是降低的［6］。BDNF過表達載體的構建，除了可補充PD病人BDNF的不足外，同時可提高移植細胞的存活率，可能是細胞移植治療PD不可或缺的部分。本研究旨在體外構建并鑒定BDNF過表達的HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經元。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光二抗（塞爾維生物公司），抗-NeuN抗體、抗-Nurr1抗體和抗-β-tubulinⅢ抗體（北京博奧森），抗-酪氨酸羥化酶（TH）抗體（購自 Abcam），DAPI（南京貝斯特公司），pEGFP-N1-GFP-BDNF慢病毒載體（漢恒生物科技有限公司），堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、成纖維生長因子 8（fibroblast growth factor 8，FGF8）、N2 因子（武漢艾美捷科技有限公司），胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、DMEM/F12基礎培養基（美國GIBCO公司），Lipofectamine 2000（上海嶸葳達實業有限公司），維生素C（Vit-c）、音猬因子（Sonic Hedgehog，SHH）、BDNF siRNA（5'-GCGCCCATGAAAGAAGTAA-3'，漢恒生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUC-MSCs的分離與培養：本實驗遵循倫理學標準和國家相關規范。在無菌條件下收集健康足月剖宮產新生兒臍帶組織（來自南京醫科大學附屬婦產醫院），用生理鹽水沖洗后去除臍動、靜脈，分離出華通氏膠并將其剪成約 1 mm的3塊小組織，接種于DMEM/F12完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱內培養。待細胞長至90%融合度時進行傳代。按照1：3傳代培養，取P3代細胞用于實驗。

1.2.2 HUC-MSCs的誘導分化：將P3代以1×104個/孔密度接種于24孔細胞培養板，培養24 h后更換神經誘導液［DMEM/F12、50μg/mLVit-c、250ng/mLSHH、100 ng/mL FGF8、50 ng/mL bFGF、N2因子（100×）］。誘導9 d后，向誘導液中加入50 ng/mL BDNF（加入BDNF時，24孔板不更換誘導液），繼續誘導3 d。每天觀察、拍照，將未誘導的HUC-MSCs作為對照。

1.2.3 免疫熒光鑒定：未分化的HUC-MSCs和HUCMSCs源性的多巴胺能神經元細胞分別以2×105/孔接種于6孔板中，培養24 h后進行免疫熒光檢測。用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。5%小牛血清蛋白（BSA）常溫封閉20 min后，分別將兔抗 NeuN（稀釋濃度為 1：500）、兔抗 β-tubulinⅢ（1：1000）的一抗加入相應孔中，4℃孵育過夜；加入相應的熒光二抗（1：100）避光孵育1 h后，PBS沖洗3次，每次5 min；加入DAPI（1：1000）避光染色10 min；50%甘油封片。熒光顯微鏡下拍照，采用Image J軟件對熒光圖片進行半定量分析。陽性表達率=陽性細胞/DAPI。

1.2.4 慢病毒介導的pEGFP-N1-GFP-BDNF的轉染與鑒定：將細胞分為HUC-MSCs組、多巴胺能樣神經元組、多巴胺能樣神經元+空載體組、多巴胺能樣神經元+BDNF載體組和多巴胺能樣神經元+BDNF siRNA組。將HUC-MSCs源性的多巴胺能樣神經元細胞接種于6孔板中，培養18～24h后，用含有6μg/mL polybrene的2 mL新鮮培養基替換原培養基，并加入30 μL的含有pEGFP-N1-GFP-BDNF的病毒懸液。37℃孵育4 h后，加入2 mL新鮮培養基稀釋polybrene，繼續培養24 h，用新鮮培養基替換含有病毒顆粒的培養基繼續培養，轉染48 h后，通過檢測綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達，證實慢病毒載體將GFPBDNF轉染到HUC-MSCs源性的多巴胺能樣神經元中。應用免疫熒光檢測轉染后各組細胞Nurr1和TH的共表達情況，檢測方法同前，其中行熒光雙標時將一抗混合液加入各組中孵育過夜，主要一抗：鼠抗Nurr1（1：1000）和兔抗 TH 的一抗（1：1000）。

1.2.5 BDNF siRNA轉染：HUC-MSCs源性的多巴胺能樣神經元細胞接種于6孔板中，待培養至70%左右融合度后，用最低必需培養基改良型減血清培養基（Opti-MEMⅠ）稀釋的Lipofectamine 2000與BDNF siRNA分別在室溫下孵育5 min，輕輕混勻，再繼續孵育20 min，然后小心加入待轉染的細胞中。細胞在37℃、5%CO2培養箱孵育72h后，在熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 5軟件進行統計處理，以均數±標準差（±s）表示。2組間比較采用 t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。每組數據來自至少3次重復實驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分離培養及誘導后HUC-MSCs的形態學變化根據上述方法從臍帶組織中分離出HUC-MSCs，培養至P3代，可見細胞大小及形態較為一致，呈梭形細胞；誘導后細胞呈神經元樣形態（圖1）。

圖1 誘導前后細胞形態學變化（×100）

2.2 HUC-MSCs誘導分化后NeuN和 β-tubulinⅢ的表達與Nurr1和TH的共表達 免疫熒光檢測結果顯示，HUC-MSCs誘導分化后，神經元特異性標記物NeuN陽性表達率為（53.88±1.31）%，較誘導前明顯增高（P＜ 0.01）；β-tubulin-Ⅲ陽性表達率為（89.22±0.94）%，也較誘導前明顯增高（P＜0.001）（圖2）；且多巴胺能神經元標記物Nurr1和TH的共表達也顯著增加（P＜0.001）（圖 3）。

圖2 免疫熒光檢測誘導前后細胞中NeuN、β-tubulinⅢ的表達

圖3 免疫熒光檢測誘導前后細胞中Nurr1和TH的共表達

2.3 轉染后各組細胞中GFP表達 熒光顯微鏡觀察結果表明，多巴胺能樣神經元+空載體組、多巴胺能樣神經元+BDNF載體組細胞中可見明顯的GFP表達；而HUC-MSCs組、多巴胺能樣神經元組和多巴胺能樣神經元+BDNFsiRNA組細胞皆未見明顯綠色熒光（圖4）。

圖4 熒光檢測各組細胞中GFP的表達（×200）

2.4 轉染后各組細胞中Nurr1和TH的共表達 免疫熒光檢測發現，與HUC-MSCs組相比，多巴胺能樣神經元組、多巴胺能樣神經元+空載體組、多巴胺能樣神經元+BDNF載體組的Nurr1和TH的共表達顯著增高（P＜0.001），多巴胺能樣神經元+BDNF siRNA組也明顯增多（P＜0.01）。多巴胺能樣神經元組和多巴胺能樣神經元+空載體組之間Nurr1和TH的共表達無明顯差異（P＞0.05）。而多巴胺能樣神經元+BDNF組Nurr1和TH的共表達較多巴胺能樣神經元組、多巴胺能樣神經元+空載體組明顯增多（P＜0.01）。多巴胺能樣神經元+BDNF siRNA組Nurr1和TH的共表達較多巴胺能樣神經元組和多巴胺能樣神經元+空載體組明顯減少（P＜0.01），較多巴胺能樣神經元+BDNF組也明顯降低（P＜0.001）（圖5）。

3 討論

圖5 免疫熒光檢測各組細胞Nurr1和TH共表達

研究證明，抑制BDNF的表達可導致大量多巴胺能神經元丟失［7］。因此，BDNF對神經元的發育、分化、存活和增殖起著重要的促進作用，并可以促進干細胞向神經元的分化與成熟，促進移植的多巴胺能樣神經元存活以及多巴胺的釋放［8-9］。已有研究表明，BDNF對神經系統退行性疾病如PD、AD等均可發揮有效的治療作用［10-11］。

本研究在體外誘導分化HUC-MSCs，發現其不僅形態上趨向于神經元，且神經元特異性標記物NeuN和β-tubulinⅢ表達明顯增加，過表達BDNF的細胞中，特異性多巴胺能神經元標記物Nurr1和TH的共表達明顯增高，證實BDNF可以促進HUC-MSCs在體外向多巴胺能樣神經元細胞分化，且分化后的細胞明顯增加。這可能是由于BDNF可通過MAPK/ERK和PI3K/Akt依賴的信號通路來刺激HUC-MSCs向神經分化，并促進分化后細胞的存活［12］，這也與以往的研究一致［13］。Nurr1是一種特異性表達于中腦多巴胺能神經元的轉錄因子，通過調節對氧化應激的抗性，起到對多巴胺能神經元保護的作用［12］。TH是多巴胺生物合成過程中的限速酶，被認為是多巴胺能神經元的特異性標記物。轉染后檢測發現，過表達BDNF的HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經元組中Nurr1和TH的共表達較HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經元組進一步增加，BDNF siRNA干擾后細胞中的Nurr1和TH的共表達顯著減少。我們的結果又進一步證明BDNF可促進多巴胺能樣神經元的分化與成熟。Chen等［15］發現，BDNF通過與高親和力受體TrkB結合，啟動PI3K/Akt/mTOR信號通路，進一步抑制細胞凋亡、促進增殖，對神經細胞起保護作用。而BDNF促進HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經元的轉化與成熟是否與PI3K/Akt信號通路有關尚待進一步研究。

總之，我們的研究結果表明，HUC-MSCs在體外可成功向多巴胺能樣神經元誘導分化，慢病毒介導的BDNF轉染HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經元能促進干細胞的分化和多巴胺能樣神經元的存活和成熟。我們推測BDNF過表達的HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經元的構建用于治療PD的療效可能優于單純的干細胞移植，但結果如何仍需在今后的體內試驗中進一步觀察與驗證。