松郁安神方對肝郁證失眠大鼠機體褪黑素水平的影響

張一帆 李星 張瑜

摘要 目的：觀察松郁安神方對肝郁證失眠大鼠機體褪黑素水平的影響。方法：將40只大鼠隨機分成正常對照組、模型組及松郁安神方低、中、高劑量組，采用慢性夾尾刺激和腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）復合因子造模法建立肝郁證失眠大鼠模型，給藥后測定肝郁證失眠大鼠機體的腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）褪黑素（MT）水平的變化。結果：肝郁證失眠大鼠機體腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）的MT水平均顯著低于正常組（P<0.05），松郁安神方低劑量組腦脊液、血清、海馬的MT水平及松郁安神方中劑量組血清的MT水平顯著高于模型組（P<0.05），而松郁安神方低劑量組血清的MT水平與松郁安神方中劑量組比較無顯著差異（P>0.05）。結論：松郁安神方對肝郁證失眠大鼠具有促睡眠作用，其作用機制可能是通過提高機體褪黑素水平而實現。

關鍵詞 松郁安神方;失眠;肝郁證;褪黑素

Abstract Objective：To observe the effect of Song Yu An Shen Fang on levels of melatonin in rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi.Methods：A total of 40 rats were randomly divided into normal control group，model group，low，medium and high dose group of Song Yu An Shen Fang group.The insomnia rat model of liver depression syndrome was established by chronic tail clamping stimulation and intraperitoneal injection of PCPA compound factor.The changes of melatonin（MT）in cerebrospinal fluid，serum and brain tissue（hypothalamus and hippocampus）of insomnia rats with stagnation of liver qi syndrome were measured after administration.Results：The MT level of cerebrospinal fluid，serum and brain tissue（hypothalamus and hippocampus）in the insomnia rats with stagnation of liver qi syndrome was significantly lower than that in the normal group（P<0.05）.The MT levels of CSF，serum and hippocampus in the low dose group and the middle dose group were significantly higher than those in the model group（P<0.05）.There was no significant difference in MT level between the low dose group and the middle dose group（P>0.05），Conclusion：The effect of Song Yu An Shen Fang on promoting sleep of insomnia with syndrome of stagnation of liver qi may be achieved by increasing the level of melatonin.

Keywords Song Yu An Shen Fang; Insomnia; Syndrome of stagnation of liver qi; Melatonin

中圖分類號：R256.23文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2020.03.074

中醫在治療失眠上有獨有的優勢，其病因病機雖復雜，但其發病與個體的體質和性格特征密切相關，臨床上多數失眠的反復發作與異常情緒常相互伴隨，并且一些針對失眠的證型和方藥研究[1，2]顯示從肝郁論治失眠具有較好療效。

黃俊山教授結合多年失眠的臨床經驗，創制了松郁安神方（藥用：甘松、郁金、玫瑰花、生龍骨、珍珠母、夜交藤、丹參、酸棗仁）主要針對肝郁證而設，功在疏肝解郁、安神定志，經臨床證實療效確切，但作用機制需要進一步明確。本文通過觀察松郁安神方對肝郁證失眠大鼠在腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）中褪黑素（MT）水平的變化，探討松郁安神方影響睡眠的藥效作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD大鼠，8周齡，體質量180～200 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[動物合格證編號：20170005009597，許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005]。將40只大鼠適應性喂養后隨機分為正常對照組、模型組、松郁安神方低劑量組、松郁安神方中劑量組、松郁安神方高劑量組，每組8只。

1.2 實驗藥物的制備 松郁安神方的組成及用量：成人（按60 kg體質量計算）用量：甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，生龍骨（先煎）30 g，珍珠母（先煎）30 g，合歡皮15 g，丹參15 g，酸棗仁15 g，所有中藥均購于福州鷺燕醫藥有限公司;大鼠用量為成人的6倍（按體質量計算），按傳統煎藥方法煎煮，濃縮，分裝滅菌后4 ℃冰箱冷藏備用;臨用前置于室溫環境下預熱（其中最終含生藥濃度低劑量為0.7 g/mL、中劑量為1.4 g/mL、高劑量為2.8 g/mL）。

對氯苯丙氨酸（PCPA）的配制：將PCPA充分研磨，用弱堿性生理鹽水助溶，臨用時配成40 mg/mL的混懸液。

1.3 造模及干預方法 采用朱潔等[3]肝郁證失眠大鼠模型的建造方法，給予大鼠慢性夾尾刺激和PCPA腹腔注射復合因子造模法，將每組大鼠置于同一籠內，用尖端包扎紗布的止血鉗分別夾大鼠尾部，令其與其他大鼠廝打，每天刺激40 min，控制刺激強度，以不破皮流血為度，連續20 d，于造模第16天起，模型組和松郁安神方低劑量組、中劑量組、高劑量組的大鼠按40 mg/100 g腹腔注射PCPA，1次/d，連續2 d;于造模第7天起，正常對照組、模型組給予生理鹽水及松郁安神方各組大鼠給藥以1 mL/（100 g·d）灌胃，連續14 d;造模第21 d，用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g體質量麻醉大鼠，以備實驗取材。

1.4 標本取材 實驗大鼠麻醉后，頭部剪毛與消毒后，剪開頭部皮膚，成十字口，從蛛網膜下腔進針，取腦脊液，離心，取上清液，置于-70 ℃保存備用;取完腦脊液后，腹主動脈取血，靜置兩小時，離心，取上清液，分裝離心管，置于-70 ℃保存備用;取血后大鼠斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側視神經后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個腦組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，冰上分離出下丘腦和海馬組織，置于-70 ℃保存備用。

1.5 指標檢測 應用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清、腦脊液、腦組織（海馬、下丘腦）的褪黑素（MT）的含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書。

1.6 統計學方法 采用IBM SPSS statistics V21.0統計軟件進行數據處理，計量數據用均數±標準差（±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，若方差齊采用LSD檢驗，若方差不齊采用Tamhane′s T2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態比較 正常對照組，精神狀態好、反應靈敏、毛發有光澤;模型組和松郁安神方各組，在第1w內，大鼠表現為易激惹、防御、抵抗和互相撕咬、尖叫明顯、反應靈活、毛發欠光澤、飲食減少;在后2w內，模型組大鼠神情倦怠、易激惹、各種防御、抵抗和互相撕咬不及之前積極、尖叫聲細、反應欠靈活、毛發干枯、有脫毛現象，符合肝郁證失眠模型的體征表現[3]，松郁安神方各組較模型組一般狀態均有改善。

2.2 各組大鼠腦脊液、血清、腦組織MT含量比較及均值圖 結果顯示，肝郁證失眠大鼠機體腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）的MT水平均顯著低于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）;松郁安神方低劑量組腦脊液、血清、海馬的MT水平及松郁安神方中劑量組血清的MT水平顯著高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），而松郁安神方低劑量組血清的MT水平與松郁安神方中劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05）。從表1、2的比較和圖1均值圖可知，劑量越大對肝郁證失眠機體褪黑素水平的影響越小。見表1、表2與圖1。

3 討論

隨著現代社會的壓力越來越大，情志不舒導致失眠占的比重日益居多，肝性喜調達惡抑郁，從肝郁論治不寐自古有之，如《辨證錄·不寐門》說：“氣郁既久，則肝氣不舒，肝氣不舒，則肝血必耗，肝血既耗，則木中之血上不能潤于心”則不寐。施明等[4]認為五臟雖皆有不寐之象，但其根源不離于肝，精神情志因素是重要環節，故指出臨床辨證用藥當從肝論治，以治肝為中心，兼顧調理其他四臟。肝郁影響肝藏血的生理功能，李世金[5]認為睡眠的晝夜節律與肝的關系密切，睡眠有明顯的生物節律性，睡眠生物節律性的調控，是通過肝藏血來完成的。

褪黑素（Melatonin，MT）：是在哺乳動物及人體松果體中分泌的主要激素，MT調節人體免疫功能、衰老等過程，褪黑素在預防皮層功能紊亂，如運動、感覺、記憶和心理損傷方面是非常有用的[6]。在褪黑素多方面調節作用中，對睡眠的調節作用顯得尤為突出，其分泌呈夜高晝低的規律，夜間褪黑素水平的高低直接影響睡眠的質量;據報道[7]褪黑素對中樞神經興奮性的抑制機制可能通過抑制一氧化氮合酶，使谷氨酸受體激活產生NO水平下降而起作用。說明MT抑制NO及MDA的升高作用，即抗自由基和抗過氧化損傷作用，可能是其發揮改善睡眠剝奪大鼠行為障礙的重要作用機制之一。腦內促睡眠系統主要包括下丘腦腹外側視前區、大腦皮質等結構的GABA能神經元及相關遞質，下丘腦視交叉上核可能是控制晝夜節律的關鍵部位;海馬在睡眠的調節中同樣起重要作用，可促進慢波睡眠，因此海馬是研究睡眠一個很有意義的觀察點[8]。大鼠的生活規律晝伏夜出，完全符合我們日間取材探討褪黑素影響睡眠的節律，因此我們選擇MT作為觀察指標，并選取了腦脊液、血清、下丘腦、海馬多部位的檢測。

肝郁證失眠和MT有一定的相關性，王志丹[9]通過失眠癥中醫證素分布規律及其與相關神經遞質、激素的關聯性研究提示中醫的病位證素肝與MT具有相關性，對失眠癥的干預可從調肝入手。王興凱[10]研究表明慢性應激肝郁證與MT之間存在明確的相關性。

基于中醫特色，目前從肝郁證論治失眠的自擬方，如黃娜娜等[11]用自擬的清肝安神湯及張麗[12]用自擬的疏肝解郁湯治療肝郁證失眠，療效明顯;松郁安神方是福建省名老中醫黃俊山教授根據多年失眠臨證經驗總結的針對肝郁證失眠的有效方劑，功用疏肝解郁，安神定志，該方重用甘松、郁金、玫瑰花疏肝解郁、調暢氣血為君，甘松現代藥理研究證實既抗焦慮又抗抑郁，改善情緒[13];生龍骨和珍珠母重鎮安神為臣，以解除肝郁氣滯，郁而化火，沖擾心神，心神不能鎮懾;佐以酸棗仁養心安神、合歡皮解郁安神、丹參寧心安神，以緩解氣郁化火，日久傷陰，陰虛火旺，沖擾肝魂，擾犯心經;該方重在疏肝解郁，兼顧重鎮安神和寧心安神，臨床療效確切，其藥效學機制需進一步闡明。

本研究結果顯示：肝郁證失眠大鼠機體腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）的MT水平均顯著低于正常組（P<0.05），驗證了肝郁證失眠和MT的相關性;松郁安神方低劑量組腦脊液、血清、海馬的MT水平及松郁安神方中劑量組血清的MT水平顯著高于模型組（P<0.05），而松郁安神方低劑量組血清的MT水平與松郁安神方中劑量組比較無顯著差異（P>0.05），提示松郁安神方低、中劑量組對肝郁證失眠機體褪黑素水平有不同程度的提高，對睡眠有一定的促進作用，松郁安神方的藥效機制可能通過調節褪黑素水平來調整睡眠。

從表1、表2的比較和圖1均值圖可知，劑量越大對肝郁證失眠機體褪黑素水平的影響越小;這與臨床用藥中，不是一味用大劑量，完全符合;考慮其原因是否劑量增加到一定程度，由促進褪黑素分泌到抑制其分泌，或有可能影響到其他神經遞質來拮抗。方劑的藥效學機制都是多方面、多靶點的，松郁安神方的調節機制還有待進一步深入探討，以期更好的為臨床服務。

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