湘西北地區規模化奶牛場犢牛腹瀉沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

李淑紅 劉勇 孫明蘭

摘要：為查明湘西北某規模化奶牛場犢牛腹瀉的主要病因，采用細菌培養、平板劃線法分離、鑒別培養基分離、革蘭氏染色、生化鑒定等方法對細菌進行分離與鑒定;選取28種抗菌藥用Kirby-Bauer紙片法進行藥敏試驗。結果表明，分離出9株沙門氏菌。沙門氏菌對丁胺卡那和頭孢他啶敏感，敏感率為7.14%;對慶大霉素和頭孢曲松中介，中介率7.14%;對諾氟沙星、紅霉素、氧氟沙星等24種藥物產生耐藥性，耐藥率為85.71%。說明沙門氏菌是引起該場犢牛腹瀉的主要原因之一，臨床上沙門氏菌的耐藥性較高，應引起高度重視。

關鍵詞：犢牛腹瀉;沙門氏菌;分離鑒定;耐藥性

犢牛腹瀉的原因較多，分為單純性腹瀉，主要是由于母牛營養不良、犢牛飼養管理不當等引起;細菌性腹瀉，主要是由致病性大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等感染引起;病毒性腹瀉，主要是由輪狀病毒、冠狀病毒等引起;寄生蟲感染引起的腹瀉，主要是由隱孢子蟲、賈第蟲、球蟲等引起[1]。腹瀉的犢牛生長發育受阻，如果不及時診斷、治療，則易導致機體抵抗力下降甚至死亡，給奶牛養殖場造成嚴重的經濟損失[2-3]。

細菌性腹瀉中的沙門氏菌（salmonella）是嚴重危害人類及畜禽健康的主要致病菌之一，各種年齡的動物均可感染，幼年動物感染率高且造成的影響和危害更嚴重[4]。湘西北地區某規模化奶牛場部分犢牛發生腹瀉，為查找病因，減少經濟損失，試驗對引起犢牛腹瀉的細菌進行分離鑒定，并對分離菌株進行藥物敏感性試驗和耐藥性分析，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來源于2018年11月湘西北地區某規模化奶牛場9頭20～40日齡腹瀉犢牛。

1.1.2 藥品及主要試劑 營養肉湯（NB）、營養瓊脂（NA）、伊紅美藍瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、SS瓊脂培養基;腸桿菌科細菌生化鑒定管（11種 10支）;結晶紫、番紅、95%乙醇等;丁胺卡那、慶大霉素、諾氟沙星等28種藥敏紙片，均購于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 垂直凈化工作臺（SP-DJ），中國上海浦東物理光學儀器廠生產;立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R），上海博迅醫療生物儀器股份有限公司生產;生化培養箱（LRH-150），上海一恒科學儀器有限公司生產;電子天平（BS223S），北京賽多利斯儀器系統有限公司生產[5]。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 用滅菌棉簽采取9頭腹瀉犢牛直腸處新鮮糞樣，分別放入有營養肉湯培養基的試管中，做好標記，將試管置于37 ℃恒溫箱中培養 18～24 h。

1.2.2 細菌分離鑒定 將增菌培養18～24 h的含病原菌的肉湯樣品，分別劃線接種于營養瓊脂（NA）、伊紅美藍瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、SS瓊脂培養基上，37 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h，觀察結果。

1.2.3 革蘭氏染色鏡檢 挑取單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.4 生化試驗 取疑是沙門氏菌的菌落接種到腸桿菌科細菌生化鑒定管中，置于37 ℃培養箱中培養18～24 h后觀察反應現象，根據沙門氏菌生化反應標準進行結果判定[6]。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法（disc agar diffusion），即Kirby-Bauer法，選用28種抗菌藥進行藥物敏感性測定[7]，藥物敏感性判斷標準分為：敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）3個等級。判定標準參照文獻[8]。

2 結果與分析

2.1 細菌在培養基中的形態學觀察

營養肉湯（NB）中為均勻渾濁，底部有少量沉淀的菌液。營養瓊脂（NA）上菌落顏色為淡黃色，表面光滑、濕潤、邊緣整齊、凸起、圓形、中等大小。在麥康凱瓊脂（MAC）和伊紅美藍瓊脂（EMB）培養基中生長為圓形、光滑、邊緣整齊無色透明的小菌落。亞硫酸鉍（BS）瓊脂為灰黑色或灰綠色圓形、光滑小菌落。SS培養基生長出無色半透明、光滑、凸起、多數中心黑色的圓形菌落，符合沙門氏菌菌落生長形態特征[9-10]。沙門氏菌在BS和SS培養基上的菌落形態特征見圖1、圖2。

2.2 革蘭氏染色結果

在油鏡（10×100倍）下可見淡粉色、細長、無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性（G-）直桿狀細菌，符合沙門氏菌特性[10]。

2.3 生化鑒定結果

細菌對靛基質、乳糖、苯丙氨酸、尿素、氨對的反應為陰性;對賴氨酸、硫化氫、衛矛醇、鳥氨酸、枸緣酸鹽反應為陽性;對葡萄糖產酸產氣。生化反應特性與沙門氏桿菌特征相符[9-10]。

經過細菌培養、分離、菌落形態觀察、鑒別培養基培養、涂片革蘭氏染色、顯微鏡觀察、生化試驗等現象進行判斷，共分離出25株細菌，其中9頭腹瀉犢牛樣品分離的9株細菌符合沙門氏菌的特征，分離率為36%，初步確定為沙門氏菌。

2.4 藥物敏感性測定結果

分離的9株沙門氏菌對所用28種藥物中的丁胺卡那和頭孢他啶敏感，敏感率為7.14%;對慶大霉素和頭孢曲松中介，中介率7.14%;對諾氟沙星、紅霉素、氧氟沙星等24種藥物產生耐藥，耐藥率為85.71%（表1）。

3 討論與小結

對湘西北奶牛場犢牛腹瀉細菌的分離結果表明，共分離25株細菌，其中在9頭腹瀉犢牛的樣本中均分離到沙門氏菌，檢出率為100%。結合犢牛腹瀉流行病學特點及臨床表現，初步確定沙門氏菌是造成該奶牛場犢牛腹瀉的主要原因之一。

經調查奶牛場在犢牛發生腹瀉病時，使用了瀉立停、諾氯沙星等藥物進行治療，但效果不明顯。藥物敏感試驗結果表明，沙門氏菌對諾氯沙星、紅霉素等24種藥產生耐藥性;對丁胺卡那和頭孢他啶2種藥敏感，對慶大霉素和頭孢曲松2種藥中介，與2006年喻華英等分離的沙門氏菌對慶大霉素中介[11]相同，對諾氟沙星極敏感、對紅霉素中度敏感存在較大差異，主要原因是臨床廣泛使用抗菌藥物防治沙門氏菌病，加之用藥不科學不規范，使沙門氏菌的耐藥現象日益嚴重，隨著時間的推移，其耐藥率大幅上升，耐藥譜不斷增寬，給我國養殖業和人類健康帶來嚴重威脅[12]。此次試驗選用的28種藥物中沙門氏菌已對24種抗菌藥產生了耐藥性，耐藥率高達85.71%，10多年前沙門氏菌對諾氟沙星、氧氟沙星等藥物現已產生了較強的耐藥性，應引起畜禽養殖場的高度重視，因此在臨床上對沙門氏菌引起的疾病治療中應科學合理使用抗菌藥，并深入開展沙門氏菌耐藥機理的研究，盡可能降低細菌耐藥性的產生。

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