AtMET1 基因在84K 楊中的遺傳轉化及誘導表達分析

吳曉娟，魯俊倩，常英英，鐘姍辰，蘇曉華，張冰玉

(林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091)

DNA 甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳修飾，它通過影響DNA 的構象、穩定性及其與蛋白質的相互作用方式以及染色質的結構等調控基因的表達[1]，在植物生長發育以及環境響應等過程中具有重要的調節作用，并能夠引起可遺傳的表觀變異[2-3]。植物體中DNA 甲基化的建立和維持受多個基因的協同調控，這些甲基化相關基因的功能缺失和超表達均能引起基因組DNA 甲基化水平的變化，從而影響基因表達；植物DNA 甲基化相關基因主要有甲基轉移酶（MET）基因、域重排甲基轉移酶（DRM）基因、染色質重塑酶（CMT）基因和DNA 甲基化轉移酶2（DNMT2）基因[4]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，MET1 基因主要維持CG 對稱位置的胞嘧啶甲基化[5-6]。擬南芥的DNA 甲基轉移酶MET1 在配子體形成過程中通過維持精細胞中印跡基因FIS2、MPC 和FWA 的甲基化來實現基因的沉默[7-9]。擬南芥MET1 弱突變體的表型變化不大，但其自交后代出現頂端優勢減弱、植株矮小、葉形改變、營養狀態差以及開花時間延遲等性狀[10]。此外，MET1還在植物逆境脅迫中發揮重要的作用[6,11-12]。Brocklehurst 等[13]研究表明，在擬南芥中，超表達MET1會在編碼轉座因子、非編碼RNA 和蛋白質的基因座上隨機產生新的表觀等位基因，這些表觀變異可傳遞給下一代；MET1 以及其他編碼表觀遺傳因子基因的超表達及抑制表達，提供了另一種鑒定表觀遺傳靶基因和創建新的表觀等位基因的策略。

Zuo 等[14]利用細菌阻遏物LexA 的DNA 結合域（DBD）和VP16 的反式激活結構域開發的基于人類雌激素受體（ ER）調節區域的誘導系統，稱為XVE 系統，它是一種高效的嚴格依賴于動物17-β-雌二醇誘導的嵌合式轉錄激活系統，能夠根據雌激素的使用劑量來嚴格控制下游基因的表達水平。目前，XVE誘導系統能夠有效控制目的基因在擬南芥[14-17]、煙草[6,18-19]、長春花[20]、水稻[21-22]和柑橘[23]等植物中的表達，并且在擬南芥中已經通過XVE 系統的應用得到了一系列的突變體[24]。目前，XVE 系統已經應用于植物基因功能研究等多個方面，是比較理想的操縱基因表達和研究基因功能的化學誘導表達系統[19]。pER8-MET1 載體是依據XVE 系統構建，研究證明17-β-雌二醇能夠有效調控煙草中外源基因的表達[6]。

本研究利用農桿菌介導法將化學誘導啟動子與擬南芥甲基化轉移酶基因AtMET1 導入銀腺楊84K（Populus alba×P.glandulosa ‘84K’）的核基因組，利用化學誘導劑17-β-雌二醇調控目的基因AtMET1 的表達，研究其在楊樹中的誘導表達特性，為建立楊樹甲基化誘導變異體系、實現楊樹品種改良和基因功能分析等奠定良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

植物材料為84K 無菌苗。農桿菌菌株GV3101、植物表達載體pER8-AtMET1 均由本實驗室保存。Premix TaqTM購自TaKaRa 公司（日本），引物由上海生工有限公司合成，DNA 測序由Invitrogen 公司（上海）完成。

1.2 方法

1.2.1 AtMET1 基因的遺傳轉化 采用電擊轉化法將植物表達載體pER8-AtMET1 轉入農桿菌GV3101，經PCR 鑒定后保菌。挑取單菌落接種于2 mL LB 液體培養基（含有50 mg·L-1壯觀霉素和17 mg·L-1利福平）中，28℃過夜振蕩培養。取2 mL 菌液接種于100 mL 與以上相同的LB 培養液中再次振蕩培養至OD 值為0.6～0.8。

取繼代培養4 周的84K 楊無菌苗頂部第3～5 片葉，切成1.5 cm×1.5 cm 的葉盤，垂直主脈切2～3 刀。將處理好的葉片放入搖好的菌液中浸染12～15 min，將葉片置于無菌濾紙上吸凈表面菌液，接種于共培養培養基（MS+0.5 mg·L-1BA+0.05 mg·L-1NAA）上暗培養 3 d 后，轉至篩選培養基（MS+0.5 mg·L-1BA+0.05 mg·L-1NAA+Timentin 200 mg·L-1+Hygromycin 3 mg·L-1）上，在溫度為28℃、16 h/8 h 光周期、光照強度1 500～2 000 lax下培養。當分化的芽長到1～2 cm 時，將其轉入生根篩選培養基(1/2MS+0.02 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1IBA+Timentin 200 mg·L-1+Hygromycin 3 mg·L-1)中進行生根篩選。

1.2.2 轉化植株的分子檢測 用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取轉基因植株及對照葉片基因組DNA。根據已知pER8-AtMET1 載體特異序列設計擴增Hygromycin 基因(HPT)的引物HP，同時擴增部分HPT 基因和AtMET1 基因的引物HM（表1），用ABI Veriti 96 孔梯度PCR 儀（ABI，美國）進行PCR 檢測，總 的 反 應 體 系 為20 μL：Premix TaqTM10 μL，Primer-F(10 μmol·L-1) 0.5 μL，Primer-R(10 μmol · L-1)0.5 μL，DNA 模板5 μL，加 ddH2O 至終體積20 μL。PCR 反應參數為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸1 min 15 s，共35 個循環；72℃終延伸7 min。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Axygen 公司（美國）瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化HM 擴增片段，連接到克隆載體pMD?19-T Vector Cloning Kit（TaKaRa，日本），轉化E.coli DH5α（TIANGEN，北京），經過藍白斑篩選，挑取陽性克隆進行DNA序列測定。用DNAMAN 9.0 軟件將測序得到的基因序列與目的基因序列進行比對。

1.2.3 轉基因植株目的基因的誘導表達 隨機取1 個轉基因株系及未轉化的84K 對照無菌苗葉片（第3～5 片葉子），切成1.0 cm×1.0 cm 的葉盤，垂直主脈切2～3 個傷口，平鋪于加有100 μmol·L-117-β-雌二醇的不定芽分化培養基上，每個平板約放10 個葉盤（葉正面朝下、保證葉盤完全接觸培養基），2 次重復，野生型對照處理0、12 h，轉基因株系處理0、3、6、12、24、48、96、144 h。處理后隨機各取5 個葉盤，液氮冷凍后保存于-80℃冰箱，用于RNA 提取。

表1 常規PCR 檢測相關引物序列Table 1 The primer sequences of PCR

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測AtMET1 基因的表達量 用EASY spin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒（Aidlab，北京）分別提取經雌激素誘導處理不同時間轉基因株系葉片的總RNA，1 μg 總RNA 用于cDNA 合成。首先去除殘留DNA，反應體系如下：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1 μg，RNase Free H2O 補足至10 μL，42℃ 2 min。向上述離心管中加入體系RNase Free H2O 4 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，混勻后37℃下反應15 min，85℃ 5 s 終止反應，-20℃保存備用。將反轉錄產物cDNA 稀釋5 倍作為反應模板，參照TaKaRa 公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase HPlus）試劑盒說明配制反應體系，總反應體系為20 μL，其中，TB Green Premix TaqII（Tli RNase HPlus）10 μL，Primer-F (10 μmol·L-1) 0.8 μL，Primer-R(10 μmol·L-1)0.8 μL，cDNA 模板2 μL，用去離子水補足至20 μL。用Roche Light Cycle 480Ⅱ型熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）進行qRT-PCR 反應，反應程序為：95℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃；50℃ 30 s。引物見表2。以Actin 為內參基因，每個樣品6 次重復，用2-ΔΔCT算法進行分析[16]。

表2 qRT-PCR 反應相關引物序列Table 2 The primer sequences of qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 84K 楊潮霉素抗性植株的獲得

取4 周大的野生型84K 楊無菌苗葉片切成葉盤后進行遺傳轉化。經過3～4 d 的共培養后將葉片放入含有3 mg·L-1潮霉素的MS 分化培養基上進行抗性篩選，約10 d 后葉盤切口處產生小的突起，35 d 后抗性芽長至0.5 cm 左右，將抗性芽連同下面的著生葉盤切下，轉移到新鮮的潮霉素分化培養基上進行二次篩選分化。經過多次篩選(圖1A)后，將伸長至1 cm 左右的抗性芽切下，并轉移到含有3 mg·L-1潮霉素的生根篩選培養基中進行生根培養，約10 d 后開始生根(圖1B)。總計轉化葉盤數約2 700 個，在分化初篩培養基上產生的抗性芽數約648 個，最終獲得18 株潮霉素抗性植株。

圖1 抗性芽及抗性植株的獲得Fig.1 The hygromycin resistant buds and resistant plants of AtMET1 transgenic P.alba×P.glandulosa ‘84K’

2.2 轉基因植株的分子檢測

提取野生型植株和18 株抗性植株的植物總DNA，以質粒為陽性對照，以野生型84K 楊為陰性對照，進行PCR 檢測。HP 引物擴增結果顯示：獲得的18 株潮霉素抗性植株的DNA 均可擴增出843 bp 的目的條帶，與預期目的條帶大小相符(圖2)；為區別導入的AtMET1 基因與楊樹基因組內的同源基因，設計HM 引物擴增從HPT 基因下游的119 bp到AtMET1 基因上游的233 bp 的序列，包含兩基因間688 bp 的間隔。PCR 結果顯示：上述18 株HP 基因陽性均能擴出1 條1 040 bp 大小的條帶，與預測目的條帶大小相符(圖3)。以上結果證明：誘導表達系統及目的基因已成功導入84K 楊，外源基因的遺傳轉化效率為2.78 %。這18 株陽性植株分別編號為AM-1～18#。

切取圖3 中目的條帶，經過膠回收純化后連入pMD?19-T Vector 載體（TaKaRa），挑取白色克隆進行DNA 測序。測序結果表明：PCR 產物序列與質粒序列比對結果相似度為100%，其中，潮霉素抗性基因的測序長度為119 bp（圖4A），AtMET1 基因的測序長度為102 bp（圖4B）。

圖2 抗性植株潮霉素抗性基因PCR 檢測Fig.2 PCR detection of HPT gene in AtMET1 transgenic P.alba×P.glandulosa‘84K’ plants

圖3 抗性植株HM 引物擴增結果Fig.3 PCR detection of HPT and AtMET1 gene in AtMET1 transgenic P.alba×P.glandulosa ‘84K’ plants

圖4 陽性植株DNA 測序比對結果Fig.4 Alignment results of HPT gene andAtMET1 gene by DNA sequencing of the transgenic P.alba×P.glandulosa‘84K’ plants.

2.3 轉基因植株誘導表達

為了研究轉基因楊樹中XVE 系統能否有效啟動目的基因表達以及其表達水平隨17-β-雌二醇處理時間變化的趨勢，分別提取用雌激素誘導處理不同時間的AM-1#離體葉片總RNA，利用qRTPCR 檢測AtMET1 基因的表達情況。結果顯示：用100 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理后，野生型植株處理12 h 與處理前一樣，都沒有目的基因的表達；轉基因植株未經誘導時目的基因沒有表達，誘導3 h 時目的基因的表達量即達到最大值，處理6 h 后表達下降，處理12 h 有所回升，處理24 h 以后表達量降低至不足處理12 h 時的一半（圖5）。以上結果說明，雌激素能夠有效誘導轉基因楊樹中XVE 系統誘導啟動子的啟動，使下游基因表達，且處理3 h時表達量最高，但隨著處理時間的延長，誘導表達效果減弱。

圖5 轉基因植株中AtMET1 的誘導表達檢測Fig.5 Expression of AtMET1in leaf of transgenic P.alba×P.glandulosa‘84K’induced by 17-β-estradiol treatment

3 討論

本研究將受17-β-雌二醇誘導的化學誘導啟動子及AtMET1 基因用農桿菌介導法導入84K 楊基因組，并利用qRT-PCR 檢測其中AtMET1 基因的表達量隨17-β-雌二醇誘導時間變化的趨勢。結果表明，處理3 h 目的基因的表達量即達到最大值，隨后在處理6 h 時表達量下降，處理12 h 時有所回升，處理24 h以后表達量降低至不足處理12 h 時的一半，說明化學誘導劑17-β-雌二醇能迅速有效地調控AtMET1 基因在楊樹中的表達。

Zuo 等[14]研究顯示，用2 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理擬南芥幼苗，目的基因的表達量隨著處理時間的增加而逐漸上升，在24 h 時達到最高后逐漸下降；代麗娟等[19]研究顯示，用2 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理煙草幼苗，在48 h 時目的基因表達量最高；梁立雄等[6]研究顯示，用50 μmol·L-1的17-β-雌二醇涂抹AtMET1 基因瞬時轉化的煙草葉片進行誘導表達時，外源在12 h 時表達量最高。本研究結果顯示，轉AtMET1 基因楊樹葉片在放置于100 μmol·L-1雌二醇培養基上時，外源基因的表達量在3 h 時達到最高，這可能是三方面的原因：一是誘導劑濃度不同，本研究依據前期實驗結果[6]，采用100 μmol·L-1的17-β-雌二醇對轉基因楊樹葉片進行處理，所用的雌激素濃度是上述研究的2～50 倍，可能導致誘導啟動子響應時間提前；二是處理方式不同，本研究對轉基因植株的離體葉片進行誘導處理，而上述研究是將雌激素加入幼苗培養基中或進行葉片涂抹的瞬時表達；三是處理對象不同，本研究首次在楊樹中采用化學誘導表達的方式，不同于擬南芥、煙草等草本植物，可能由于物種的差異導致響應時間的不同。后續研究將在0～3 h 之間進行時間細化處理，看其是否在3 h前就已達到平臺期。在處理6 h 時，目的基因的表達降低，其原因可能是AtMET1 基因在楊樹中表達量達到一定程度時，與RdDM（RNA-directed DNA methylation）相互作用發生了轉錄基因沉默（TGS，transcriptional gene silencing）[25]，即siRNA（Small interfering RNA）對靶mRNA 產生了降解[26]。隨著誘導時間的延長，目的基因的表達量逐漸降低，這可能與17-β-雌二醇的降解有關，Snyder 等[27]研究表明，當暴露于290～720 nm 之間的模擬太陽光時，光降解17-β-雌二醇可達26%。

本研究發現，XVE 系統在楊樹中對目的基因AtMET1 的調控強度低于其在煙草中對目的基因的調控強度[6]，其原因可能是其表達方式上的差異導致的，在煙草中所采用的是瞬時表達方式，而本實驗中所采用的是穩定表達方式[28]。此外，本研究通過遺傳轉化，獲得了潮霉素抗性芽648 個，經生根篩選及分子檢測最后獲得了18 株轉基因植株，遺傳轉化效率僅為2.78%，低于以往84K 楊的遺傳轉化效率7%[29]。因為前期實驗已經確定了最佳的潮霉素分化選擇壓[4]，假陽性較高不可能是由于分化培養基中潮霉素選擇壓偏低導致的。其原因主要是由于葉盤篩選培養時邊緣上翹導致部分非抗性再生芽的產生，以及轉化過程中出現了嵌合體[30]。

本研究將受17-β-雌二醇調控的XVE 系統及AtMET1 基因成功導入白楊派優良品種84K 楊的基因組，通過qRT-PCR 證實AtMET1 基因能夠在化學誘導劑的誘導下表達，并且隨誘導時間的不同而表達量有很大差異。由于植物不具有類似的激素系統[31]，植物生長環境下外源基因并不表達，不會影響植物的正常生長發育。通過人為17-β-雌二醇處理，能夠嚴格控制外源基因AtMET1 的表達，進而能夠通過對轉基因植株誘導前后基因組甲基化狀況以及表型性狀的對比，排除轉基因過程中其他因素干擾所導致的突變[19]，為進一步研究MET1 基因在楊樹基因組甲基化調控方面的作用機制奠定基礎。

4 結論

本研究在前期研究[6]的基礎上，將含有AtMET1基因的載體轉化農桿菌感受態細胞，通過葉盤法侵染、潮霉素篩選，獲得陽性植株；通過 PCR 擴增及DNA 測序，結果表明，化學誘導啟動子及目的基因已成功導入84K 楊基因組中，獲得了84K 楊的轉AtMET1 基因植株18 株；同時，通過化學誘導表達實驗，證明了化學誘導啟動子在楊樹中能夠有效發揮作用，并且目的基因的表達受到17-β-雌二醇的嚴格控制，最適雌激素處理時間是3 h，但隨著時間的延長效果減弱。為楊樹品種改良以及基因功能分析等奠定了良好的基礎。