漢源花椒總黃酮提取物的抗氧化及抗Hela腫瘤細(xì)胞增殖活性研究

徐一鳴,郭秀蘭,李秋霞,李俊鋒,唐仁勇,鄒 強(qiáng),杜小剛

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川雅安 625014)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)系蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物,其果實(shí)是我國(guó)特別是西南地區(qū)的特色調(diào)味品,以味麻著稱,具有降血脂[1]、抗氧化[2]、抑菌抗蟲[3]等保健功能。花椒在全國(guó)各地都有栽種,而其中又以漢源花椒較為出名,漢源花椒是我國(guó)雅安市漢源縣特產(chǎn),與其他花椒相比具有色澤鮮艷和麻味濃厚等特點(diǎn)。從唐代開始,漢源花椒就是朝廷貢品,因此又被稱為貢椒[4]。漢源花椒產(chǎn)量高,主要產(chǎn)品為花椒粉、花椒油等調(diào)味料。花椒內(nèi)含有揮發(fā)油[5]、總黃酮、總多酚[6]等多種活性成分,其中的黃酮是一類具有2-苯基色原酮(2-phenyl-chromones)結(jié)構(gòu)的多酚類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤[7]等生物活性。

自由基是一類具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán),具有很高的氧化活性,很容易與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。適量自由基可以促進(jìn)膠原蛋白和凝血酶原的合成并提高人體免疫力;而過量的自由基會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)功能和引起基因損傷并導(dǎo)致變異[8],甚至引發(fā)心血管疾病、癌癥、炎癥和糖尿病等疾病[9-10]。因此,有效抑制自由基的氧化反應(yīng)顯得至關(guān)重要。合成抗氧化劑具有潛在毒副作用[11],目前研究熱點(diǎn)主要集中在具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物。已有研究表明花椒葉的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性[12],但是關(guān)于漢源花椒抗氧化性方面的研究還鮮有報(bào)道。

癌細(xì)胞是由正常細(xì)胞的原癌基因與抑癌基因發(fā)生突變產(chǎn)生的,具有可以無(wú)限增殖、易轉(zhuǎn)化和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),這也是惡性腫瘤形成的原因。化療和放療是治療惡性腫瘤的主要手段,但對(duì)正常細(xì)胞有強(qiáng)烈的副作用;而近年來(lái)天然產(chǎn)物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)黃酮可以抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞分裂周期和抑制腫瘤新生血管形成,具有良好的抗腫瘤活性[13],是一類良好的可用作癌癥治療的天然產(chǎn)物資源。但是目前還沒有關(guān)于花椒黃酮抗腫瘤細(xì)胞增殖方面的研究。

因此,本實(shí)驗(yàn)以漢源花椒總黃酮提取物為實(shí)驗(yàn)材料,通過DPPH自由基、·OH清除等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)總黃酮提取物的體外抗氧化能力,并以不同濃度提取物處理Hela細(xì)胞,研究對(duì)Hela細(xì)胞的抗增殖作用,以期為漢源花椒功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢源花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim) 產(chǎn)地為四川漢源;Hela細(xì)胞 中科院上海生科院細(xì)胞資源中心;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;CCK-8試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司;碘化丙啶(PI) 凱基生物科技發(fā)展有限公司;EGFP-Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 廣州易錦生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 北京索萊寶科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京索萊寶科技有限公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ3200DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;BIOMATE 3S 分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;Forma Steri-Cycle CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;Synergy HT酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-TEK公司;Sorvall ST 16R離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;Accuri C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漢源花椒總黃酮的提取 參考楊立琛等[14]和李谷才等[15]方法,并做出一定改進(jìn)。稱取2 g的花椒粉末,加到35 mL石油醚中,常溫,150 W密封超聲30 min,抽濾后留粉末烘干并轉(zhuǎn)移到三角瓶中,然后加入20%乙醇80 mL,65 ℃,150 W密封超聲2 h,抽濾取大孔樹脂。加入60%乙醇80 mL，常溫振蕩4 h(120 r/min)抽濾留濾液,再加入10 g預(yù)處理后的D101-大孔吸附樹脂(蒸餾水浸泡24 h,反復(fù)沖洗至無(wú)渾濁;4%NaOH浸泡12 h,蒸餾水洗至中性;4%HCl浸泡12 h，蒸餾水洗至中性;95%乙醇浸泡3 h,蒸餾水洗至無(wú)醇味)常溫振蕩4 h(120 r/min),抽濾后取大孔樹脂，加入60%乙醇80 mL，常溫振蕩4 h(120 r/min)抽濾留濾液。再將濾液進(jìn)行50 ℃旋蒸,當(dāng)濾液渾濁且無(wú)酒精蒸出后停止旋蒸,最后濾液在-80 ℃冰箱過夜后使用凍干機(jī)凍干。

1.2.2 黃酮得率測(cè)定 參考宋倩等[16]方法,稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL容量瓶中,用60%乙醇定容得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加到10 mL容量瓶中(0、1、2、3、4、5 mL),加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液,反應(yīng)6 min,然后加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液,反應(yīng)6 min,最后加入4 mL 4% NaOH溶液4 mL,用30%乙醇定容后搖勻,顯色15 min。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立方程為y=6.39x-0.0112,R2=0.9995,y為吸光度,x為黃酮質(zhì)量濃度mg/mL。

提取黃酮得率的測(cè)定:稱取10 mg凍干得到的總黃酮提取物溶于10 mL 30%乙醇配制樣品液,取1 mL樣品液按上述方法測(cè)定吸光度,黃酮濃度使用上述方程計(jì)算。黃酮得率計(jì)算按下列公式:

式中,C提為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出來(lái)的黃酮提取液中黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V樣為乙醇體積,mL;m提為凍干后總黃酮提取物總質(zhì)量,mg;m花為花椒粉末質(zhì)量,g;m樣為稱取的凍干后總黃酮提取物質(zhì)量,mg。

1.2.3 漢源花椒總黃酮提取物抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力檢測(cè) 參考Amarowicz等[17]方法,使用甲醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、25、50、75、100、125 μg/mL),取1 mL待測(cè)液加到1 mL,0.5 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液中,再用甲醇定容到5 mL。搖勻靜置30 min。空白對(duì)照組用蒸餾水代替DPPH。在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,根據(jù)下列公式計(jì)算清除率:

式中,A0為質(zhì)量濃度為0的吸光度;A測(cè)為不同質(zhì)量濃度下的吸光度;A空為不同質(zhì)量濃度下空白對(duì)照組吸光度。

1.2.3.2 羥自由基(·OH)清除能力檢測(cè) 參考范菁華等[12]方法,使用無(wú)水乙醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、62.5、125、250、400、500 μg/mL),反應(yīng)體系為1 mL待測(cè)液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液、1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和1 mL H2O2溶液,混勻后37 ℃水浴1 h,空白對(duì)照組用蒸餾水代替水楊酸。在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,根據(jù)下列公式計(jì)算清除率:

式中,A0質(zhì)量濃度為0的吸光度;A測(cè)為不同質(zhì)量濃度下的吸光度;A空為不同質(zhì)量濃度下空白對(duì)照組吸光度。

1.2.3.3 還原力檢測(cè) 參考高亞妮等[18]方法,使用70%乙醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、25、50、100、200、400 μg/mL),取2.5 mL待測(cè)液,加到2.5 mL 10 mg/mL鐵氰化鉀中,50 ℃水浴20 min,然后加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸,混勻后離心20 min(3000 r/min),再取2.5 mL上清液,加入蒸餾水2.5 mL和1 mg/mL FeCl30.5 mL,搖勻靜置10 min。在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,吸光度越大,代表還原力越強(qiáng)。

1.2.3.4 總抗氧化能力檢測(cè) 參考Ozkan G等[19]方法,使用無(wú)水乙醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、50、100、200、250、300 μg/mL)和磷鉬試劑液(含0.6 mol/L濃硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨),取0.4 mL待測(cè)液,加到4 mL磷鉬試劑液中,搖勻后95 ℃水浴加熱90 min,在695 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,吸光度越大,代表總抗氧化能力越強(qiáng)。

1.2.4 漢源花椒總黃酮提取物抗增殖活性的測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于培養(yǎng)瓶中,使用含10%胎牛血清,1‰青霉素鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基,在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),每?jī)商靷鞔淮巍?/p>

1.2.4.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞,按8000個(gè)細(xì)胞,75 μL/孔接種于96孔板上,空白對(duì)照組按75 μL/孔加入含血清1640培養(yǎng)基;使用含2‰ DMSO的無(wú)血清培養(yǎng)基配制藥物(花椒總黃酮濃度0、50、100、200、400、800 μg/mL),接種細(xì)胞4 h后按75 μL/孔加入96孔板。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12、24、48 h后,按10 μL/孔加入CCK-8溶液后再孵育1 h,然后在450 nm酶標(biāo)儀下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞生存率:

式中,A0為提取物質(zhì)量濃度為0的吸光度;A測(cè)為不同質(zhì)量濃度下的吸光度;A空為不同質(zhì)量濃度下空白對(duì)照組吸光度。

1.2.4.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 參考李云坤等[20]方法,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞,按3×105個(gè)細(xì)胞,1 mL/孔接種于12孔板上;使用含2‰ DMSO的無(wú)血清培養(yǎng)基配制藥物(花椒總黃酮提取物0、100、200、400、800、1600 μg/mL),接種細(xì)胞6 h后按1 mL/孔加入12孔板,在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液離心(300×g,5 min)收集細(xì)胞,然后用4 ℃預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗兩次(800 r/min,5 min),再用預(yù)冷70%乙醇重懸細(xì)胞,4 ℃冰箱過夜,次日使用預(yù)冷PBS洗一次,最后加入500 mL PBS(含50 μg/mL PI和100 μg/mL RNA酶),4 ℃避光反應(yīng)20 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),每次計(jì)數(shù)20000個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果使用FLOWJO-V10軟件分析。

1.2.4.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞,按5×105個(gè)細(xì)胞,1 mL/孔接種于6孔板上;使用含2‰DMSO的無(wú)血清培養(yǎng)基配制藥物(花椒總黃酮提取物0、100、200、400、800、1600 μg/mL),接種細(xì)胞6 h后按1 mL/孔加入6孔板,在5%CO2、37 ℃飽和濕度下孵育24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液離心(300×g,5 min)收集細(xì)胞于5 mL流式管內(nèi),然后用4 ℃預(yù)冷的PBS洗兩次,再使用100 μL 1×Annexin-binding buffer重懸細(xì)胞,接著加入5 μL EGFP AnnexinV和2 μL PI,輕輕混勻,室溫避光反應(yīng)15 min,最后加入400 μL 1×Annexin-binding buffer,檢測(cè)前放置于冰上。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),每次計(jì)數(shù)20000個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,結(jié)果使用FLOWJO-V10軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用GraphPad prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多組間單因素分析使用One-way ANOVA,雙因素分析使用two-way ANOVA,P<0.05表示有顯著差異,P<0.01表示有非常顯著差異,P<0.001表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒黃酮的得率

本研究采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取,繼而用大孔樹脂純化并冷凍干燥得到花椒黃酮提取物,其黃酮得率為2.19%,略高于用超聲波輔助提取法提取四川花椒果實(shí)黃酮得率(2.13%)[15],說(shuō)明提取方法是可行的。

2.2 花椒黃酮的抗氧化性

黃酮具有強(qiáng)抗氧化性的原因主要是在于其芳香環(huán)上的羥基,它們可結(jié)合并清除自由基,且清除能力與羥基的數(shù)目和位置有關(guān)[21-22]。本研究測(cè)定了總黃酮提取物對(duì)DPPH自由基和·OH的清除率,并評(píng)價(jià)了對(duì)三價(jià)鐵的還原能力與誘導(dǎo)形成磷鉬絡(luò)合物的能力,從多個(gè)方面研究了總黃酮提取物的抗氧化能力。

2.2.1 黃酮提取物清除DPPH自由基能力 由圖1可知,總黃酮提取物對(duì)DPPH自由基有清除效果,并且隨著質(zhì)量濃度增大,清除率迅速提高。在提取物質(zhì)量濃度為125 μg/mL清除率最大達(dá)到84.70%,此質(zhì)量濃度下VC的清除率為94.51%,總黃酮提取物與VC的IC50值分別為65.61和4.92 μg/mL。因此,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),總黃酮提取物具有較好的DPPH自由基清除效果且呈劑量依賴性,清除能力弱于VC,但是強(qiáng)于黃秋葵黃酮與氯仿萃取的鐵皮石斛黃酮[23-24],它們的IC50值分別為2980.00和394.62 μg/mL。

圖1 總黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids extracts on DPPH·

2.2.2 總黃酮提取物清除·OH能力 由圖2可知,總黃酮提取物有清除·OH的能力,并且隨著質(zhì)量濃度增大,清除能力逐漸增強(qiáng);在質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)清除率最大達(dá)到83.61%,此質(zhì)量濃度下VC的清除率為84.07%,VC和總黃酮提取物的IC50值分別為189.80、194.40 μg/mL。因此,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),總黃酮提取物對(duì)·OH有一定清除能力,并呈劑量依賴性,其清除能力和VC相比無(wú)較明顯差異,但是強(qiáng)于黃秋葵黃酮與氯仿萃取的鐵皮石斛黃酮,IC50值分別為6000.00和1589.03 μg/mL[24-25]。

圖2 總黃酮提取物對(duì)·OH清除效果Fig.2 Scavenging effects of total flavonoids extracts on ·OH

2.2.3 總黃酮提取物還原力 由圖3可知,總黃酮提取物具有還原力,并且隨著質(zhì)量濃度增大,吸光度呈上升趨勢(shì)且接近線性,即還原能力不斷增強(qiáng)。在提取物質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí),吸光度為0.70,而此質(zhì)量濃度下VC的吸光度為1.48。因此,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),總黃酮提取物具有一定的還原力且呈劑量依賴性,雖然其還原力不如VC,但大于堿蓬黃酮(25～50) mg/mL[25]。

圖3 總黃酮提取物還原力Fig.3 Reducing power of total flavonoids extracts

2.2.4 總黃酮提取物總抗氧化活性 由圖4可知,總黃酮提取物具有總抗氧化能力,并且隨著質(zhì)量濃度增大,吸光度緩慢增長(zhǎng),即抗氧化活性緩慢提高。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí),吸光度達(dá)到最大值0.48;而此質(zhì)量濃度下VC吸光度為1.54。因此,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),總黃酮提取物有一定的抗氧化能力,且呈劑量依賴性,在質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)總抗氧化能力高于該質(zhì)量濃度下的茼蒿葉總黃酮[26],但遠(yuǎn)弱于VC。

圖4 總黃酮提取物總抗氧化能力Fig.4 Total anti-oxidative power of total flavonoids extracts

總的來(lái)說(shuō),漢源花椒總黃酮提取物具有抗氧化活性,雖然抗氧化活性不如VC,但是DPPH自由基與·OH清除率的IC50值小于黃秋葵黃酮和鐵皮石斛黃酮,相同質(zhì)量濃度下的還原力強(qiáng)于堿蓬黃酮,總抗氧化能力強(qiáng)于茼蒿葉黃酮,說(shuō)明漢源花椒具有良好的抗氧化活性,是一種有開發(fā)價(jià)值的植物資源。

2.3 總黃酮提取物對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

由圖5可知,總黃酮提取物引起細(xì)胞生存能力下降,并且隨著提取物質(zhì)量濃度提高,細(xì)胞生存能力在逐漸下降;與相同處理時(shí)間的對(duì)照組相比,用200～800 μg/mL總黃酮提取物處理12 h后極顯著降低了Hela細(xì)胞的生存能力(P<0.001);用50 μg/mL處理24 h后顯著降低了Hela細(xì)胞的生存能力(P<0.01);100～800 μg/mL處理24 h極顯著地降低了Hela細(xì)胞的生存能力(P<0.001);用50～800 μg/mL處理48 h后極顯著地降低了Hela細(xì)胞的生存能力(P<0.001)。且生存能力隨黃酮濃度的增加而降低,在800 μg/mL時(shí)不同處理時(shí)間的細(xì)胞生存率達(dá)都到最低,12、24和48 h分別為27.15%、10.43%和30.63%;IC50值分別為454.3、271.1和361.9 μg/mL。因此,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),總黃酮提取物能顯著抑制Hela細(xì)胞增殖,且呈劑量依賴性;但可能是因?yàn)榧?xì)胞的適應(yīng)能力,提取物長(zhǎng)時(shí)間處理后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果減弱,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選擇提取物抑制效果最好的處理時(shí)間24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同質(zhì)量濃度下Hela細(xì)胞的生存能力Fig.5 Viabilities of Hela cells at various mass concentrations注:**表示相同處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異 非常顯著(P<0.01);***表示相同處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組 與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.001);圖6～圖8同。

2.4 總黃酮提取物對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期阻滯是指正常細(xì)胞受到外來(lái)因子的刺激后,周期調(diào)控蛋白的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常有絲分裂,從而引起細(xì)胞增殖抑制。由圖6可知,總黃酮提取物使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后處于各周期細(xì)胞數(shù)量所占比例分別為:G0/G1期57.76%,S期27.23%和G2/M期22.49%;在最高質(zhì)量濃度下G0/G1期細(xì)胞數(shù)量所占比例極顯著下降到40.85%(P<0.001),S期為28.7%,無(wú)明顯變化,而G2/M期極顯著上升到40.01%(P<0.001)。這與前人結(jié)果類似,研究表明植物黃酮類物質(zhì)有阻滯癌細(xì)胞分裂的作用:木犀草素-7-O-葡萄糖苷通過上調(diào)JNK信號(hào)通路引起人肝癌HepG2細(xì)胞的G2/M期阻滯[27]、黃芪總黃酮和毛蕊異黃酮通過下調(diào)G1/S-特異性周期蛋白D1的表達(dá)使K562人慢性髓系白血病細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞增多[28]。因此,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),高質(zhì)量濃度的總黃酮提取物會(huì)擾亂Hela細(xì)胞正常周期,使其阻滯在G2/M期,干擾了細(xì)胞正常有絲分裂的進(jìn)行

圖6 不同質(zhì)量濃度下細(xì)胞周期分布比例Fig.6 Proportion of the cell cycle distribution at various mass concentrations

。

2.5 總黃酮提取物對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞自殺,是細(xì)胞為了維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)主動(dòng)進(jìn)行的程序性死亡,受一系列基因的調(diào)控,這也是抑制細(xì)胞增殖的原因之一。由圖7、圖8可知,總黃酮提取物會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且隨著藥物質(zhì)量濃度上升,細(xì)胞凋亡率逐漸升高。對(duì)照組細(xì)胞藥物處理24 h后的早期凋亡率(LR)為4.25%,晚期凋亡率(UR)為12.18%,早期和晚期凋亡率都隨黃酮提取物濃度的增加而逐漸提高,當(dāng)800 μg/mL濃度處理24 h后早期凋亡率達(dá)到15%,晚期凋亡率達(dá)到74.3%,極顯著高于對(duì)照組(P<0.001),且鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有明顯的凋亡小體。這與前人結(jié)果相似:槲皮素可以通過上調(diào)AMPK/p38信號(hào)通路誘導(dǎo)HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[29]。因此總黃酮提取物會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴性,這很可能是提取物引起細(xì)胞增殖抑制的原因。

圖7 總黃酮提取物對(duì)Hela細(xì)胞凋亡影響Fig.7 Effect of total flavonoids extracts on the apoptosis of Hela cells

圖8 不同質(zhì)量濃度下細(xì)胞凋亡率Fig.8 Cell apoptosis rates at various mass concentrations

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取結(jié)合大孔樹脂純化的方法制備了漢源花椒黃酮,并研究其抗氧化活性及對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明,漢源花椒總黃酮提取物具有較強(qiáng)的DPPH和羥自由基的清除能力,同時(shí)具備一定的還原力與總抗氧化能力;腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)漢源花椒黃酮在800 μg/mL處理24 h可最大限度地降低Hela細(xì)胞生存率,這可能與該濃度提取物處理24 h的細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡率升高有關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明漢源花椒黃酮具有良好的抗氧化活性,且具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性,是一種具有開發(fā)價(jià)值的植物資源。