黃酒多肽的多級(jí)分離純化及其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響

馮瑞雪,史 瑛,姬中偉,錢肖華,徐岳正,毛 健,*,許正宏,*

(1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫214122; 2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江紹興312000)

黃酒是中國(guó)歷史上最悠久的傳統(tǒng)釀造酒,自古被視為我國(guó)傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健品[1]。黃酒中的肽類含量豐富、具有多種生物活性,氨基酸含量為13.5 g/L,含量是啤酒的7.55倍,比白酒多2.09倍[2],故開展黃酒多肽分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及功能性研究是十分必要的。黃酒多肽主要來(lái)源于原料分解與微生物代謝積累,釀造黃酒的原料如糯米等富含豐富的蛋白質(zhì),微生物體內(nèi)含有各種代謝酶,因此在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生多種不同功能的活性肽[3]。

炎癥是機(jī)體對(duì)感染、組織損傷及傷害性刺激等做出的保護(hù)性反應(yīng),是伴隨很多疾病如高血脂、糖尿病、癌癥等的一種共有病理現(xiàn)象。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對(duì)機(jī)體有免疫增強(qiáng)的作用[4],但過(guò)度的免疫應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致組織損傷[5],對(duì)人體產(chǎn)生重大傷害[6-7]。巨噬細(xì)胞是主要的炎癥細(xì)胞,當(dāng)其受到外界抗原(如LPS)刺激時(shí)會(huì)釋放NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等一系列炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[8]。目前黃酒多肽已有很多活性如抗氧化活性等的報(bào)道[9-10],但黃酒多肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性的調(diào)節(jié)功能還未被深入研究。免疫調(diào)節(jié)肽是一類對(duì)生物機(jī)能有益的蛋白肽,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的分泌、炎性介質(zhì)的合成分泌以及炎癥信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)生物體的炎癥反應(yīng)[11],通過(guò)分離純化技術(shù)對(duì)所得到的黃酒多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和進(jìn)一步活性分析,繼而確定可能的構(gòu)效關(guān)系,這將為黃酒多肽保健功能的研究提供重要的理論依據(jù)。

本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥模型,初步探討黃酒多肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性的調(diào)節(jié)作用,為黃酒多肽的保健功能及研究開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ),通過(guò)食物或藥食同源的方式起到調(diào)節(jié)免疫活性的效果,具有較高的經(jīng)濟(jì)和研究?jī)r(jià)值,同時(shí)也促進(jìn)黃酒在大健康背景下的進(jìn)一步發(fā)展和食品產(chǎn)業(yè)升級(jí)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒 紹興;小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS) 美國(guó)Gibco;二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)、脂多糖(LPS)、噻唑藍(lán)(MTT)、Griess reagent 美國(guó)Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗青霉素(104μg/mL,鏈霉素104μg/mL) Hyclone;Sephadex G-15凝膠填料 上海源葉生物科技有限公司;BCA檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物公司;其他試劑 均為分析純。

Beta 1-8 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;冷凍離心機(jī) 艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司;SY2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司;SynergyH1全功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek;小型超濾裝置 美國(guó)Millipore公司;DHL-A恒流泵、HD-3紫外檢測(cè)儀、DBS-100電腦全自動(dòng)收集器 上海滬西分析儀器廠;Agilent1260液相色譜 安捷倫公司;SHA-C往復(fù)水浴振蕩器 上海百典儀器設(shè)備有限公司;PL6001E天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;AL204分析天平 無(wú)錫旭野科技有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞營(yíng)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔樹脂吸附黃酒多肽及條件優(yōu)化

1.2.1.1 黃酒預(yù)處理 循環(huán)水式真空泵抽濾黃酒使其過(guò)0.22 μm的微孔濾膜,去除黃酒中分子量較大的固形物。實(shí)驗(yàn)用超濾組件經(jīng)過(guò)0.1 mol/L NaOH溶液洗滌后用蒸餾水洗至流出液為中性后方可使用。研究表明,肽類的分子量一般在3 kDa以下才具有特殊的生理活性,故通過(guò)超濾系統(tǒng)分級(jí)超濾酒樣,取小于3 kDa的組分進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 大孔樹脂預(yù)處理 95%乙醇浸泡D101、DA201、DA201-C三種大孔樹脂24 h,蒸餾水清洗大孔樹脂至無(wú)明顯乙醇?xì)馕?流出液清澈透明、無(wú)渾濁物后,分別用1 mol/L的HCl和4% NaOH浸泡24 h,以去除樹脂在合成過(guò)程中的雜質(zhì),避免對(duì)樣品的吸附造成影響[12],樹脂洗至中性后濾去水分備用。

1.2.1.3 大孔樹脂的篩選 不同性質(zhì)大孔樹脂適合分離的物質(zhì)不同,綜合考慮大孔樹脂對(duì)黃酒多肽的吸附率、解析率篩選樹脂。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研后選取3種不同型號(hào)的大孔樹脂,其各種參數(shù)見表1。

表1 樹脂的物理參數(shù)Table 1 The physical properties of macroporous resin

參考文獻(xiàn)[9]確定條件即分別稱取三種經(jīng)過(guò)1.2.1.2方法預(yù)處理的樹脂10 g(干重)置于錐形瓶中,加入預(yù)處理之后的黃酒樣品100 mL,于25 ℃、150 r/min條件下吸附24 h,測(cè)定上清液中多肽濃度Ce,并按照公式分別計(jì)算多肽的吸附量Ac和吸附率A。

吸附率A(%)=100×(C0-Ce)/C0

吸附量Ac(mg/g)=V0×(C0-Ce)/W

式中:C0(mg/mL)表示溶液中多肽的初始濃度;Ce(mg/mL)表示大孔樹脂吸附多肽達(dá)到吸附平衡時(shí)的濃度;V0表示樣品的體積(mL);W表示樹脂的干重(g)。

1.2.1.4 樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1.3的方法進(jìn)行靜態(tài)吸附24 h,每隔1 h測(cè)定上清液中多肽濃度Ce。通過(guò)BCA試劑盒檢測(cè)、按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多肽濃度,后按照公式計(jì)算吸附率A[13]。

1.2.1.5 洗脫劑濃度的選擇 收集吸附黃酒多肽后的DA201-C大孔樹脂,抽濾去除濾液,用適量蒸餾水沖洗濾干后加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,25 ℃、150 r/min條件下洗脫24 h,抽濾后測(cè)定多肽含量。按照上述方法依次進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液洗脫,并按公式計(jì)算大孔樹脂解析率Dr。洗脫液經(jīng)旋蒸去除乙醇后凍干,所得凍干粉即為黃酒多肽SJ。

解析率Dr(%)=Cd×Vd/(Ac×W)

式中:Cd(mg/mL)表示洗脫樣品多肽濃度;Vd(mL)表示洗脫液的體積。

1.2.2 凝膠色譜層析 參考文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行Sephadex G-15葡聚糖凝膠預(yù)處理及裝柱。裝柱后用蒸餾水平衡2個(gè)柱體積至檢測(cè)器基線平穩(wěn)。用蒸餾水將黃酒多肽組分SJ配成濃度為16 mg/mL的溶液,經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾分離層析系統(tǒng),蒸餾水(pH7.0)為流動(dòng)相,流速為3 mL/min,洗脫液自動(dòng)部分收集,合并同一分離峰的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥后得三個(gè)組分即G1、G2、G3。

1.2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基,于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種,放置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[16],取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 細(xì)胞活力的測(cè)定 黃酒多肽SJ、G1、G2、G3樣品(0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/mL)溶解于DMEM高糖培養(yǎng)基,過(guò)0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜。對(duì)照組即正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,樣品干預(yù)組即含黃酒多肽樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞,按每孔1×104細(xì)胞接種于96孔板中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加黃酒多肽樣品。加完樣品1 h后加入LPS(終濃度為1 μg/mL)。24 h后,每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基后向各孔中加入150 μL的DMSO,酶標(biāo)儀低速振蕩使結(jié)晶充分溶解后測(cè)定各孔在490 nm下的吸光值[17]。細(xì)胞存活率按如下公式計(jì)算:

細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100

式中,As:實(shí)驗(yàn)孔;Ab:空白孔(僅含培養(yǎng)基);Ac:對(duì)照孔(含細(xì)胞與培養(yǎng)基)。

1.2.3.3 形態(tài)學(xué)變化的觀察 實(shí)驗(yàn)分組包含對(duì)照組、LPS組、樣品干預(yù)組。黃酒多肽SJ樣品(0.3、2.5 mg/mL)溶解于DMEM高糖培養(yǎng)基,過(guò)0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔2×106細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄除培養(yǎng)液。對(duì)照組加正常培養(yǎng)基;LPS組加2 mL濃度為1 μg/mL的含LPS培養(yǎng)基;樣品干預(yù)組加含黃酒多肽樣品的培養(yǎng)基,1 h后加入LPS(濃度最終為1 μg/mL),放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞在不同種類、濃度黃酒多肽樣品干預(yù)下形態(tài)的變化并拍照。

1.2.3.4 NO釋放量的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組包含對(duì)照組、LPS組、樣品干預(yù)組。黃酒多肽SJ、G1、G2、G3樣品(0.3、0.6、1.2、2.5 mg/mL)溶解于DMEM高糖培養(yǎng)基,過(guò)0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔1×104細(xì)胞接種于96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄除培養(yǎng)液。對(duì)照組加正常培養(yǎng)基;LPS組加200 μL濃度為1 μg/mL的含LPS培養(yǎng)基;樣品干預(yù)組加含黃酒多肽樣品的培養(yǎng)基,1 h后加入LPS(濃度最終為1 μg/mL),放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。Griess法檢測(cè):取50 μL細(xì)胞上清液與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(80、40、20、10、5、2.5、0 μmol/L)于96孔板中,后在各孔中加入50 μL Griess試劑,酶標(biāo)儀540 nm條件下測(cè)定各孔OD值。以亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸,OD值為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線性方程為:y=0.0055x+0.0066決定系數(shù)R2=0.9987。一氧化氮抑制率按以下公式計(jì)算為:

抑制率(%)=(LPS組-樣品組)×100/(LPS組-對(duì)照組)

1.2.4 氨基酸組成的分析 對(duì)NO釋放抑制率最高的黃酒多肽組分G1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,稱取0.1 g樣品加到水解管中,加入6 mol/L的HCl溶液,充氮?dú)馐谷芤撼饰⒎袪顟B(tài),然后密封水解管,在120 ℃條件下水解22 h,反應(yīng)結(jié)束后打開水解管,待溶液冷卻后加入10 mol/L NaOH中和,用蒸餾水定容至25 mL。雙層濾紙過(guò)濾收集上清液過(guò)微孔濾膜(孔徑0.22 μm),然后采用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016、Graphpad Prism 7等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖譜制作。其中,顯著性差異分析使用Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行,多組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比采用ANOVA檢驗(yàn),采用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示數(shù)據(jù)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過(guò)大孔樹脂吸附黃酒中的多肽及條件優(yōu)化

2.1.1 具有最佳黃酒多肽吸附效果的大孔吸附樹脂篩選 在生物活性肽的研究中,分離純化是關(guān)鍵環(huán)節(jié),只有達(dá)到一定純度,活性肽的功能性研究才得以展開[9]。大孔吸附樹脂的吸附是基于化合物與吸附劑間的范德華引力與靜電引力,故不同大孔樹脂適合吸附的物質(zhì)不同,通過(guò)前期文獻(xiàn)調(diào)研及預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出了三種適用于黃酒多肽分離的大孔樹脂,但仍需進(jìn)一步篩選具有最佳黃酒多肽得率的大孔吸附樹脂。由表2可得,大孔吸附樹脂DA201對(duì)黃酒多肽的吸附量最大,其次是DA201-C、D-101。另外比較解吸率可知,DA201-C的解吸率高于另外2種樹脂。因此,結(jié)合吸附量和解析率的結(jié)果可知[18],大孔吸附樹脂DA201-C最適用于黃酒多肽的分離。故本實(shí)驗(yàn)選取DA201-C型大孔樹脂進(jìn)行吸附解析黃酒多肽。

表2 不同型號(hào)樹脂對(duì)黃酒多肽的吸附率解析率及吸附量Table 2 Adsorption and desorption ratio and adsorption capabilities of huangjiu peptides on different macroporous resins

2.1.2 DA201-C大孔樹脂的靜態(tài)吸附曲線 如圖1所示,樹脂DA201-C在靜態(tài)吸附過(guò)程中對(duì)黃酒多肽吸的附率呈現(xiàn)隨時(shí)間增加先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。在前3 h吸附率增加較快,在3 h時(shí)大孔樹脂對(duì)黃酒多肽的吸附率達(dá)到53.41%。3 h后大孔樹脂DA201-C對(duì)黃酒多肽的吸附率基本維持平衡,表示大孔樹脂吸附達(dá)到飽和,樹脂表面已被吸附物分子占滿,這與文獻(xiàn)報(bào)道的吸附狀況一致[19]。

圖1 DA201-C樹脂對(duì)多肽的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curve of static adsorption of peptide with resin DA201-C

2.1.3 黃酒多肽最佳解析率的乙醇體積分?jǐn)?shù)確定 乙醇溶液通過(guò)削弱吸附物多肽與吸附劑大孔樹脂之間的疏水相互作用,從而使吸附物洗脫下來(lái),且乙醇溶液無(wú)毒性、易濃縮去除、便于樣品的回收,所以實(shí)驗(yàn)最終選擇乙醇為洗脫劑對(duì)吸附于大孔樹脂上的黃酒多肽進(jìn)行解析。從圖2可知,隨乙醇濃度增加,多肽的解析率先增加后降低,在乙醇濃度為60%達(dá)到最大。當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí),部分小分子蛋白可能變性導(dǎo)致洗脫液渾濁從而增加洗脫難度。故本實(shí)驗(yàn)采取靜態(tài)吸附后蒸餾水沖洗吸附飽和的樹脂去除未吸附組分,再用60%乙醇溶液進(jìn)行洗脫的方法。洗脫液通過(guò)旋蒸凍干后得到大孔吸附樹脂分離黃酒多肽組分,即為SJ組分。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多肽解析率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ethanol on desorption of peptides注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;圖7、圖8同。

2.2 黃酒多肽SJ的Sephadex G-15凝膠色譜層析

為將黃酒多肽SJ組分中多肽進(jìn)一步分離純化,采用葡聚糖凝膠色譜柱Sephadex G-15進(jìn)行下一步分離純化。如圖3所示,大孔樹脂吸附解析后得到的黃酒多肽組分SJ進(jìn)一步通過(guò)葡聚糖凝膠色譜柱進(jìn)行洗脫分離,得到了3個(gè)洗脫峰,以洗脫時(shí)間為X軸,以紫外檢測(cè)的OD值為Y軸作圖。收集這3個(gè)主要的峰,分別命名為G1、G2、G3。將各組洗脫液冷凍干燥,儲(chǔ)存-20 ℃下待用。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性,對(duì)活性最高組分進(jìn)行氨基酸組成分析。

圖3 Sephadex G-15純化黃酒多肽SJ的柱層析圖Fig.3 Sephadex G-15 column chromatography of the huangjiu peptides SJ

2.3 各級(jí)分離黃酒多肽樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響

2.3.1 各級(jí)分離黃酒多肽樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.3.1.1 大孔吸附樹脂分離所得黃酒多肽SJ組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 為了研究黃酒多肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)源性的保護(hù)作用,首先排除多肽自身對(duì)于細(xì)胞毒性作用的干擾,故本實(shí)驗(yàn)采用MTT法來(lái)檢測(cè)不同的多肽濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響。不同濃度黃酒多肽SJ(0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/mL)干預(yù)后的RAW264.7細(xì)胞的存活率如圖4所示。結(jié)果顯示RAW264.7細(xì)胞的存活率隨著多肽濃度升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)SJ濃度為5 mg/mL時(shí),RAW264.7細(xì)胞的存活率與對(duì)照組相比高度顯著下降(P<0.001),此時(shí)細(xì)胞的存活率僅為69.55%;黃酒多肽SJ在0.02～2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)干預(yù)巨噬細(xì)胞后,各組細(xì)胞存活率仍均高于95%,表明黃酒多肽SJ在此濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7無(wú)明顯的毒性作用。因此,選取黃酒多肽SJ組分在0.02～2.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同濃度黃酒多肽SJ對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of huangjiu peptides SJ concentration on the viability of RAW264.7 cells注:與對(duì)照組B相比,*:代表差異顯著(P<0.05),**:代表差異很顯著(P<0.01),***:代表差異高度顯著(P<0.001),****:代表差異極顯著(P<0.0001);圖5同。

2.3.1.2 凝膠層析分離所得三種黃酒多肽組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 為了研究葡聚糖凝膠柱分離出來(lái)的3種組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響,首先需分析3種組分即G1、G2、G3對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。如圖5可知,葡聚糖凝膠層析分離的3種組分濃度范圍為0.02～2.5 mg/mL時(shí),RAW264.7細(xì)胞存活率都在90%以上,這表明此濃度范圍內(nèi)的3種組分對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)顯著的影響(P>0.05)。因此,3種葡聚糖凝膠層析分離組分選擇0.02～2.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同濃度Sephadex G-15分離組分 對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effects of the fractions concentrations eluted from Sephadex G-15 on the viability of RAW264.7 cells

2.3.2 大孔吸附樹脂分離黃酒多肽SJ組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 有研究表明RAW264.7細(xì)胞的最佳形態(tài)是“小、圓、亮”的單核細(xì)胞,此種形態(tài)細(xì)胞對(duì)藥物刺激敏感,貼壁狀態(tài)正常,易于消化。故在本試驗(yàn)中,采用此種形態(tài)細(xì)胞[7]。

將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察,在400倍鏡下,正常培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)如圖6A所示,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),形態(tài)呈現(xiàn)小而圓;當(dāng)細(xì)胞受到LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞狀態(tài)如圖6B所示,LPS刺激細(xì)胞后細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),細(xì)胞膨脹且部分呈現(xiàn)梭形;低、高濃度黃酒多肽SJ干預(yù)細(xì)胞后LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞狀態(tài)如圖6C、D所示,在黃酒多肽SJ干預(yù)下受LPS誘導(dǎo)的RAW264.7的形態(tài)趨于正常形態(tài),且隨著黃酒多肽SJ樣品濃度的增加,保護(hù)效果越明顯,細(xì)胞形態(tài)越趨于正常,故黃酒多肽SJ可能對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖6 黃酒多肽SJ對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞形態(tài)影響(400×)Fig.6 Effects of the huangjiu peptides SJ on morphology of RAW264.7 cells(400×)注:A:對(duì)照孔;B:LPS孔;C:SJ濃度為 0.3 mg/mL;D:SJ濃度為2.5 mg/mL。

2.3.3 各級(jí)分離純化樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO釋放量的影響

2.3.3.1 大孔吸附樹脂分離黃酒多肽SJ組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO釋放量的影響 巨噬細(xì)胞在急性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用,脂多糖LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量NO,過(guò)量的NO會(huì)促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展,故本實(shí)驗(yàn)以LPS為刺激物建立體外炎癥模型。通過(guò)Griess法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清液NO的含量,通過(guò)計(jì)算NO抑制率來(lái)評(píng)價(jià)抗炎活性的強(qiáng)弱[20]。

由圖7可知,對(duì)照組NO釋放量為1.89 μmol/L;僅LPS誘導(dǎo)細(xì)胞時(shí)NO的釋放量為16.17 μmol/L,LPS組NO釋放量是對(duì)照組的8.56倍,說(shuō)明炎癥模型建立成功。

圖7 不同濃度黃酒多肽SJ對(duì)RAW264.7分泌NO的影響Fig.7 Effect of huangjiu peptides SJ concentrations on the production of NO in RAW264.7 cells

樣品干預(yù)組中(LPS和黃酒多肽SJ共同作用),隨著黃酒多肽SJ樣品濃度的增加,NO的釋放量呈現(xiàn)出劑量依賴性下降。當(dāng)濃度為0.3、0.6、1.2、2.5 mg/mL的黃酒多肽SJ作用于RAW264.7時(shí),NO的釋放抑制率分別為

20.85%、36.42%、68.58%、95.01%,說(shuō)明經(jīng)大孔樹脂吸附的黃酒多肽SJ能夠顯著抑制NO的釋放(P<0.05)。并且隨著黃酒多肽濃度的增加,NO的抑制率增加。說(shuō)明黃酒多肽SJ組分可以抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激,避免巨噬細(xì)胞的過(guò)度炎癥反應(yīng)。因此,要想繼續(xù)分析具體哪種結(jié)構(gòu)的黃酒多肽的活性更高,需要進(jìn)一步純化黃酒多肽組分SJ[21]。

2.3.3.2 凝膠層析分離所得三種黃酒多肽組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO釋放量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示,葡聚糖凝膠層析分離組分G1、G2、G3的IC50分別是0.68、0.86、0.75 mg/mL,其中G1活性最強(qiáng)。并與大孔吸附樹脂分離黃酒多肽SJ組分的IC50的0.79 mg/mL相比,IC50值更低,說(shuō)明G1能更好地抑制由LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中NO的釋放,從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,在3種組分中具有相對(duì)更好的活性,故對(duì)其進(jìn)行氨基酸分析。

圖8 不同濃度Sephadex G-15分離組分 對(duì)RAW264.7分泌NO的影響Fig.8 Effect of the fractions concentrations eluted from Sephadex G-15 on the production of NO in RAW264.7 cells

2.4 氨基酸組成分析

氨基酸的組成分析是多肽化學(xué)研究中最基本的內(nèi)容之一[22]。生物活性肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息與其特定的生物活性存在密切聯(lián)系[23],氨基酸組成及序列信息、肽的疏水性、帶電性質(zhì)、分子量大小、肽鏈長(zhǎng)度以及所包含的微量元素等對(duì)其生理活性有著重要影響[24]。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定了G1組分能更好地抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激,由表3可知,谷氨酸(24.41 g/100 g)是G1組分含量最豐富的氨基酸,其次是苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸;甲硫氨酸是含量最低的氨基酸;疏水氨基酸占總氨基酸含量的32.63%。與文獻(xiàn)中報(bào)道的活性肽中高疏水性氨基酸含量對(duì)免疫調(diào)節(jié)活性有重要影響這一結(jié)論具有一致性[25],強(qiáng)疏水作用能夠使活性肽與細(xì)胞膜產(chǎn)生相互作用以發(fā)揮免疫作用。由于黃酒多肽G1中肽段較多,具體哪條肽段具有較強(qiáng)免疫活性尚未明確,仍需要進(jìn)行下一步分離純化,明確不同分子量段肽段的氨基酸序列,通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)比分析肽段結(jié)構(gòu)與免疫活性的關(guān)系,日后應(yīng)加強(qiáng)解析構(gòu)效關(guān)系為免疫調(diào)節(jié)肽作用提供理論基礎(chǔ)。

表3 G1組分的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of fraction G1

3 結(jié)論

通過(guò)大孔吸附樹脂及葡聚糖凝膠進(jìn)行多級(jí)分離純化得到黃酒多肽組分,通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)和NO釋放量評(píng)價(jià)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫調(diào)節(jié)活性最高的黃酒多肽組分。結(jié)果表明:通過(guò)大孔樹脂吸附黃酒獲得了具有較高免疫調(diào)節(jié)活性的黃酒肽組分SJ。黃酒多肽SJ組分通過(guò)Sephadex G-15凝膠層析進(jìn)一步分離純化,得到3種組分,其中對(duì)NO釋放抑制率最高的黃酒多肽組分為G1,其NO抑制IC50為0.68 mg/mL。由氨基酸分析可知G1的免疫調(diào)節(jié)活性與其氨基酸組成有關(guān),疏水氨基酸含量對(duì)免疫活性有重要影響。