超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜快速篩查和定量檢測食用油脂中的天然辣椒素、合成辣椒素和二氫辣椒素

劉詩瑤,吳文林,肖全偉,梁恒興,茍興華

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106; 2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院,四川成都 610100)

回收油脂又稱地溝油、老油、潲水油,主要是指剩飯、剩菜(通稱泔水)收集后的上層浮油[1]。近年來,我國報(bào)道了多起“地溝油事件”,引起了社會(huì)各界的關(guān)注。2015年《食品安全法》中明確規(guī)定“禁止生產(chǎn)經(jīng)營用回收食品作為原料生產(chǎn)的食品”[2],但回收油脂成本低廉,監(jiān)管難度大,使得不法商家有機(jī)可乘,導(dǎo)致回收油脂回流餐桌、流入食品生產(chǎn)中的現(xiàn)象屢禁不止,嚴(yán)重危害人民群眾的健康。為此,2017年6月,原國家食藥監(jiān)總局辦公廳公開征集“地溝油”補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,2018年2月發(fā)布了BJS 201801《食用油脂中辣椒素的測定》補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,但該方法需用標(biāo)準(zhǔn)品作為對照,且存在檢測成本高、效率較低、假陽性率高等缺點(diǎn)。因此,建立一種快速、可靠的食用油脂中非法添加回收油脂的篩查確證和定量方法是當(dāng)務(wù)之急。

辣椒是我國含油餐飲食品如中餐、火鍋等普遍使用的香辛調(diào)味料,辣椒素類化合物是其主要呈味物質(zhì)[3]。這類物質(zhì)脂溶性強(qiáng)、耐高溫,性質(zhì)極為穩(wěn)定,目前的廢棄油脂處理工藝如水洗、脫膠、脫色、脫酸、除臭、精濾等并不能完全去除[4]。因此,如食用油脂中檢出含有辣椒素,則可以判定該油脂使用或非法添加了回收油脂。

目前已見報(bào)道檢測辣椒素的方法主要有液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]等。液相色譜法靈敏度較低、假陽性率高,難以定性。以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為代表的低分辨質(zhì)譜法,同樣存在選擇性差、定性能力弱、假陽性率高等缺點(diǎn)[11]。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜(Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap mass spectrometry,UHPLC-Q/Orbitrap)是最新的高分辨質(zhì)譜技術(shù),其分辨率高達(dá)280000,且具有質(zhì)量精度高,對前處理凈化能力要求低,假陽性率低等優(yōu)勢。其不僅可以在無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)情況下進(jìn)行高通量的快速篩查和確證,還可在有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)情況下進(jìn)行高靈敏度的定量分析[12]。Orbitrap目前已廣泛應(yīng)用于食品添加劑[13-15]、農(nóng)藥殘留[16-19]、獸藥殘留[20-22]、真菌毒素[23-25]等的篩查、確證和定量。目前尚未見用Orbitrap技術(shù)分析食用油脂中辣椒素的報(bào)道。

本文首次構(gòu)建了UHPLC-Q/Orbitrap快速篩查和定量檢測食用油脂中天然辣椒素、合成辣椒素和二氫辣椒素的方法。該方法通過建立3種辣椒素的高分辨質(zhì)譜信息數(shù)據(jù),可在無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下利用一級精確質(zhì)量數(shù)和二級碎片精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行快速篩查,同時(shí)可在有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下對的陽性樣品進(jìn)行定量分析;最后通過實(shí)際陽性樣品檢測,驗(yàn)證方法的可靠性。本方法為食用油脂中非法添加回收油脂行為的篩查確證和準(zhǔn)確定量檢測提供了新的技術(shù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20組食用油樣品 均購自成都本地超市;2組精煉回收食用油脂 由實(shí)驗(yàn)室模擬工廠工藝自制,樣品詳細(xì)信息見表1;甲醇和乙腈(質(zhì)譜級) 德國Merck公司;二氯甲烷(色譜純) 德國Merck公司;甲酸(質(zhì)譜級) 美國Sigma-Aldrich公司;濃硫酸和氫氧化鈉(分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(6 cc,500 mg) 美國Waters公司;一次性濾膜(0.22 μm PTFE) 美國Agilent公司;天然辣椒素(Capsaicin,純度99.0%)、合成辣椒素(Nonivamide,純度99.0%)、二氫辣椒素(Dihydrocapsaicin,純度99.0%)等3種標(biāo)準(zhǔn)品 均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(包括Vanquish超高效液相色譜儀和Q Exactive Plus四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀,配有HESI可加熱電噴霧離子源及Trace Finder 4.1數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)) 美國Thermo Fisher公司;MS105DU十萬分之一天平 瑞士Mettler-Toledo公司;ME203萬分之一天平 瑞士Mettler-Toledo公司;Lab Dancer渦旋混合器 德國IKA公司;Milli-Q純水機(jī) 美國Millipore公司;N-EVAP-24位氮吹儀 美國Organomation公司;TGL-16M臺式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;超聲波清洗機(jī) 湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別稱取適量天然辣椒素、合成辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品,以甲醇為溶劑,分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將3種辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱中避光保存。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取 準(zhǔn)確稱取油樣1 g(精確至0.1 mg)于10 mL離心管中,加入1 mL二氯甲烷,再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液,渦旋3 min,超聲3 min,10000 r/min離心10 min,取上層水相;殘留有機(jī)相再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液同法操作,合并水相,再用稀硫酸(1+15)溶液調(diào)節(jié)pH至2～3之間,待凈化。

1.2.2.2 凈化 將水相提取液直接加載到6 mL規(guī)格Oasis PRiME HLB固相萃取柱,無需活化和平衡,保持每秒1～2滴的流速,收集洗脫液,40 ℃氮?dú)獯抵两?殘?jiān)?.0 mL甲醇定容,過0.22 μm PTFE濾膜,上機(jī)分析測定。

1.2.2.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取食用油脂陰性樣品,按1.2.2節(jié)前處理濃縮至近干后,加入1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶,渦旋混勻,過0.22 μm PTFE濾膜,上機(jī)分析。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:Thermo Scientific Accucore Vanquish C18+色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.5 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水,B為0.1%甲酸乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫條件:0～1 min,15% B;1～2 min,90% B;2～4 min,90% B;4～4.1 min,15% B;4.1～5 min,15% B。進(jìn)樣量:2 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源:HESI源;噴霧電壓:3.5 kV;離子傳輸管溫度:320 ℃;鞘氣(N2)流速:35 arb;輔助氣(N2)流速:10 arb;吹掃氣(N2)流速:0 arb;加熱器溫度:350 ℃;S-len:60。掃描模式:正離子模式;采集方式:全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描(Full MS/dd-MS2);掃描范圍:100～400 m/z;分辨率:一級70000,二級17500;歸一化碰撞能:20%、40%和60%;AGC target:一級1 e6、二級2 e5;最大注入時(shí)間:一級100 ms、二級50 ms;循環(huán)數(shù):3;MSX數(shù):1;隔離寬度:1.5 m/z;動(dòng)態(tài)排除:5 s。3種辣椒素的其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 3種辣椒素的其他質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Other mass spectrometry conditions of the 3 kinds of capsaicinoid

1.2.4 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算 本實(shí)驗(yàn)采用相對響應(yīng)值法消除基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)采用以下公式計(jì)算:

式中:A和B分別為3種辣椒素混和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?本實(shí)驗(yàn)中為純甲醇)中的儀器響應(yīng)值。基質(zhì)效應(yīng)為正表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),為負(fù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用美國Thermo Fisher的Tracefinder 4.1和Xcalibur 4.2軟件進(jìn)行分析,Originpro 2018制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱選擇

近年來,固相萃取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品的前處理凈化,其具有操作方便、溶劑消耗低、特異性強(qiáng)、回收率高的優(yōu)點(diǎn)[26-28]。本實(shí)驗(yàn)比較了Waters PRiME HLB、Agilent EMR-Lipid和Agela Cleanert S C18三種固相萃取小柱的凈化效果。結(jié)果顯示,三種固相萃取小柱的回收率均大于90%,如圖1。但考慮到C18小柱除油脂效果差,EMR-Lipid前處理操作相對繁瑣,最終選用PRiME HLB固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化。

圖1 固相萃取柱對提取回收率的影響Fig.1 Effects of different solid-phase extraction column on the recovery rate

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度為50 μg/L的3種辣椒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用UHPLC-Q/Orbitrap對混合標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行Full MS/dd-MS2方式全掃描,得到一級全掃描質(zhì)譜圖,以各化合物的分子離子峰理論精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖,確定目標(biāo)物為[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰。3種辣椒素的相對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.005‰,符合高分辨質(zhì)譜要求。在進(jìn)行一級全掃描的同時(shí),采用數(shù)據(jù)依賴性二級掃描,通過二級譜圖進(jìn)行進(jìn)一步定性。依據(jù)目標(biāo)物的分子式和碎片離子信息擬合出理論精確質(zhì)量數(shù)。3種辣椒素的母離子、碎片離子等信息見表2。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

3種辣椒素均為弱極性化合物,在C18色譜柱上均有較好的保留。采用Thermo Accucore Vanquish C18+(100 mm×2.1 mm,1.5 μm)分離3種辣椒素,5 min內(nèi)完成分析。發(fā)現(xiàn)其對三種辣椒素保留均較好,目標(biāo)峰響應(yīng)高,峰形尖銳且對稱。這可能是因?yàn)锳ccucore Vanquish色譜柱的1.5 μm的實(shí)心核顆粒帶來了更好的柱效。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用Thermo Accucore Vanquish C18+(100 mm×2.1 mm,1.5 μm)分離。

取陰性食用油脂樣品,按1.2.2節(jié)前處理方法濃縮至近干后,加入1.0 mL質(zhì)量濃度為50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈和水-乙腈作流動(dòng)相,結(jié)果顯示,以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相,基線噪音最低,峰型和靈敏度最佳。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相,采用梯度洗脫分離。加標(biāo)食用油脂基質(zhì)溶液中3種辣椒素(50 μg/L)的提取離子流色譜圖見圖2。

圖2 加標(biāo)食用油脂基質(zhì)溶液中3種辣椒素(50 μg/L)的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of the 3 kinds of capsaicinoid(50 μg/L)spiked in the edible oil matrix solution

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 選取不同基質(zhì)的空白食用油脂樣品,按照1.2.2進(jìn)行樣品前處理,提取空白基質(zhì)分別配制0.1、1、5、10、20和40 μg/L不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,上機(jī)檢測,繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,3種辣椒素在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,決定系數(shù)R2≥0.999。

表3 3種辣椒素的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限(n=6)Table 3 Linear ranges,linear equations,determination coefficients,matrix effects,LODs and LOQs of the 3 kinds of capsaicinoid(n=6)

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 本實(shí)驗(yàn)選擇響應(yīng)值法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),三種辣椒素的基質(zhì)效應(yīng)均較小(表3)。但考慮到食用油脂摻入回收油脂后基質(zhì)變復(fù)雜,因此本實(shí)驗(yàn)中依舊采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,外標(biāo)法定量。

2.4.3 檢出限和定量限 本實(shí)驗(yàn)采用美國國家環(huán)境保護(hù)局(EPA)推薦方法確定方法的檢出限。以飛行時(shí)間質(zhì)譜、靜電場軌道阱質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜依靠提取精確質(zhì)量數(shù)來進(jìn)行定量,但其色譜圖的噪聲幾乎可以忽略不計(jì)[29]。本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)做低濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),重復(fù)進(jìn)樣6次,根據(jù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差確定檢出限和定量限。結(jié)果表明,天然辣椒素、合成辣椒素和二氫辣椒素的方法檢出限分別為0.02、0.05和0.02 μg/kg,方法定量限分別為0.1、0.2和0.1 μg/kg(見表3)。

2.4.4 回收率和精密度 為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度,選取有代表性的空白食用油脂基質(zhì)(6號樣品調(diào)和油)進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),平行測定6次,加標(biāo)回收率及RSD結(jié)果見表4。從表4可以看出,3種辣椒素的平均回收率均在66.7%～112.8%范圍內(nèi),RSD為3.2%～9.7%,均小于10%。

表4 在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions at three spiked levels(n=6)

2.5 方法適用性和實(shí)際樣品檢測

選取20組食用油脂和2組精煉廢棄食用油脂樣品對上述構(gòu)建的檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,市場購買的菜籽油等食用油脂均未檢出三種辣椒素,而實(shí)驗(yàn)室自制的2組精煉廢棄食用油脂(陽性樣品)均檢出三種辣椒素,其中21號樣品天然辣椒素、合成辣椒素和二氫辣椒素的含量分別為0.0035、0.0003和0.0036 μg/kg,22號樣品為0.003、0.0002和0.0029 μg/kg,結(jié)果也印證了回收食用油脂的回收精煉工藝并不能完全去除掉這三種辣椒素。由此可見,該方法可以快速篩查食用油脂是否摻雜了回收食用油脂,并可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。

3 結(jié)論

本文通過對儀器條件和樣品前處理的優(yōu)化,首次建立了UHPLC-Q/Orbitrap快速篩查食用油脂中3種辣椒素的分析方法。其平均回收率在66.7%～112.8%范圍內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2%～9.7%范圍內(nèi);檢出限在0.02～0.05 μg/kg之間,定量限在0.1～0.2 μg/kg之間。該方法通過Orbitrap技術(shù)建立了3種辣椒素高分辨質(zhì)譜信息數(shù)據(jù),適用于在無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下,運(yùn)用快速的前處理方法可對大批量食用油樣品中3種辣椒素進(jìn)行快速篩查及確證,且可在有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下進(jìn)行高靈敏度的定量分析。本方法為食用油脂中非法添加回收油脂行為的篩查確證和定量檢測提供了新的技術(shù)和新思路。