低分子量酵母甘露聚糖的制備及其抗氧化性研究

趙國群,申崇宇,季小莉,孫 旭

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018; 2.滄州醫學高等專科學校,河北滄州 061001)

酵母細胞壁約占細胞干重的25%～30%。甘露聚糖位于酵母細胞壁的外層,約占細胞壁干重的40%[1]。酵母甘露聚糖是一種多糖,主鏈由多個甘露糖分子通過α-1,6-糖苷鍵連接形成。主鏈上連接有以α-1,2-糖苷鍵或α-1,3-糖苷鍵連接的甘露糖側鏈,它通過O-糖肽鍵和N-糖肽鍵與蛋白質連在一起[2]。酵母甘露聚糖通常含有5%～20% 蛋白質和80%～90%甘露糖,其相對分子量為20～200 kDa[3]。由于能夠增加動物的免疫能力、調節腸道菌群平衡、促進益生菌生長、結合吸附外源性病原菌,因而酵母甘露聚糖已作為飼用添加劑應用于飼料工業[4]。此外,酵母甘露聚糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂等多種生理功能,是一種極具潛力的功能性食品配料[5-6]。

作為生物高分子化合物,多糖的生理活性,不僅取決于多糖的組成及結構,也與多糖的相對分子量及分布、支化度、鏈構像等性質密切相關[7]。有研究表明,小分子多糖具有比大分子多糖更強的抗氧化活性[8-9]。國內報道的酵母甘露聚糖的制備方法有酸法[10]、堿法[11]、高溫水提法[12]和酶法[13]。采用這些方法制備甘露聚糖時,基本上都忽視了所制備甘露聚糖的分子量問題,而低分子量甘露聚糖以及甘露寡糖的制備尚極少研究。飼料級酵母甘露寡糖(Mannanoligosaccharide)已經在美國實現了工業化生產,但其制備方法及其具體分子量仍處于保密狀態[14]。本文首先采用環境友好型高溫水提法制備出酵母甘露聚糖,然后探索不同的降解酵母甘露聚糖的方法,并對篩選出的降解方法進行工藝優化,以期為開發低分子量酵母甘露聚糖以及甘露寡糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母(活性干酵母粉) 安琪酵母股份有限公司;無水乙醇 天津市百世化工有限公司;30% H2O2天津市永大化學試劑開發中心;甘露聚糖酶 南寧龐博生物工程有限公司;葡聚糖標準品(Dextran,1、5、12、25、50、270、410 kDa) 美國Sigma公司;鄰二氮菲、鄰苯三酚、維生素C 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

SPX-250B-Ⅱ生化培養箱 上海賀德實驗設備有限公司;D-1型自動蒸汽滅菌鍋 北京發恩科貿有限公司;KQ-800DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;P70D20TL-D4微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實業有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;LC1100安捷倫液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;Waters 2695 型凝膠滲透色譜系統 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母甘露聚糖的提取及精制 將活性干酵母粉用去離子水配制成細胞濃度為15%(w/w)的菌懸液,調節菌懸液pH為6.0,于55 ℃恒溫水浴鍋中自溶40 h,離心收集菌體,并用去離子水洗滌3次。稱取自溶后的酵母細胞濕菌體,配制成15%(w/w)的菌懸液,調節菌懸液pH為7.0,于121 ℃蒸汽滅菌鍋內高溫抽提4 h。高溫抽提結束后,離心,獲得不完全透明的上清液,即甘露聚糖提取液。采用Sevage法[15]去除甘露聚糖提取液中游離蛋白。將脫蛋白后甘露聚糖提取液真空濃縮至原體積的1/6,向甘露聚糖濃縮液中加入無水乙醇,調乙醇體積分數為90%進行醇沉(4 ℃、10 h),離心,收集沉淀,分別用乙醚、丙酮洗滌,45 ℃真空干燥得甘露聚糖干粉。經過測定,所制備酵母甘露聚糖樣品的甘露聚糖含量95.23%、蛋白含量3.56%,其重均分子量為76.52 kDa。

1.2.2 酵母甘露聚糖的微波降解 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水配制成30 g/L甘露聚糖溶液,在微波功率750 W條件下微波加熱15 min。

1.2.3 酵母甘露聚糖的超聲波降解 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水配制成30 g/L甘露聚糖溶液,在超聲功率800 W、超聲溫度80 ℃條件下超聲處理45 min。

1.2.4 酵母甘露聚糖的H2O2氧化降解 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水和30% H2O2配制成H2O2終濃度為5%、糖濃度為30 g/L的甘露聚糖溶液,置于70 ℃水浴中保溫1 h。

1.2.5 酵母甘露聚糖的酶法降解 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水配制成30 g/L甘露聚糖溶液,加入0.5 g甘露聚糖酶,調節糖液pH6.0,然后置于60 ℃水浴中保溫5 h。

1.2.6 酵母甘露聚糖H2O2降解的單因素實驗

1.2.6.1 溫度對甘露聚糖降解的影響 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水和30% H2O2配制成H2O2終濃度為5%、糖濃度為30 g/L的甘露聚糖溶液,分別置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中保溫1 h。

1.2.6.2 H2O2濃度對甘露聚糖降解的影響 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水和30% H2O2配制30 g/L甘露聚糖溶液,其H2O2終濃度分別控制為3%、5%、7%、9%、11%,置于90 ℃水浴中保溫1 h。

1.2.6.3 H2O2處理時間對甘露聚糖降解的影響 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水和30% H2O2配制成H2O2終濃度為9%、糖濃度為30 g/L的甘露聚糖溶液,置于90 ℃水浴中分別保溫0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.6.4 糖濃度對甘露聚糖降解的影響 稱取3.0 g酵母甘露聚糖干粉,用去離子水和30% H2O2配制成H2O2終濃度為9%、糖濃度分別為20、30、40、50、60 g/L的甘露聚糖溶液,置于90 ℃水浴中保溫2.5 h。

1.2.7 酵母甘露聚糖H2O2降解工藝的優化 在單因素實驗結果的基礎上,采用L9(34)正交實驗設計方法,考察了溫度、時間、H2O2濃度和甘露聚糖濃度對甘露聚糖降解的影響。正交實驗設計因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.8 甘露聚糖重均分子量(Mw)的測定 采用凝膠滲透色譜法,測定酵母甘露聚糖樣品及其降解處理后樣品的重均分子量[16]。色譜條件:色譜柱為PL aquagel-OH 8;流動相為超純水;流速 1.0 mL/min;柱溫 30 ℃;進樣量 20 μL。以標準葡聚糖分子量的對數lg Mw為縱坐標,保留時間tR為橫坐標,繪制“lg Mw-tR”標準曲線,標準曲線方程為:lg Mw=-0.3267tR+8.7935,R2=0.993。

1.2.9 酵母甘露聚糖的體外抗氧化活性

1.2.9.1 羥基自由基清除能力的測定 參照文獻[17],配制濃度分別為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L的酵母甘露聚糖樣品溶液。在試管中分別加入1 mL鄰二氮菲乙醇溶液(0.75 mmol/L),2 mL磷酸緩沖溶液(0.2 mmol/L,pH7.4),1 mL酵母甘露聚糖水溶液,1 mL硫酸亞鐵溶液(0.75 mmol/L),搖勻,最后加入1 mL 0.01% H2O2,37 ℃水浴1 h,于510 nm處測定其吸光值A。以維生素C作為陽性對照。羥基自由基(·OH)清除率計算公式如下:

·OH清除率(%)=(A試樣-A1)/(A0-A1)×100

式中:A0為空白的吸光值;A試樣為樣品的吸光值;A1為背景的吸光值。

式中:A0為空白對照組的吸光值;A1為樣品組、陽性對照組的吸光值。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次,采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行處理,試驗結果以均值±標準偏差(Mean+SD)表示。

2 結果與分析

2.1 不同方法降解甘露聚糖效果的比較

本研究比較了微波降解法、超聲波降解法、生物酶法和H2O2降解法四種方法,結果見圖1。

圖1 不同方法降解酵母甘露聚糖的結果Fig.1 The results of yeast mannan degradation with different methods

從圖1可以發現,與未經降解處理的對照相比,微波處理后的甘露聚糖重均分子量幾乎沒有降低,這表明微波降解法無效。然而,毛江江等[19]研究發現微波處理可以降解殼聚糖;黃永春等[20]報道微波處理可以降解魔芋葡甘聚糖,造成這種現象的原因尚不清楚,可能與酵母甘露聚糖的分子結構有關。采用甘露聚糖酶處理也不能明顯降低酵母甘露聚糖重均分子量,其原因是本研究使用的β-甘露聚糖酶,而酵母甘露聚糖的糖苷鍵是α構型,目前尚未見到商品α-甘露聚糖酶。采用超聲波處理后,酵母甘露聚糖的重均分子量由76.52 kDa降低到了70.22 kDa,這說明超聲波處理稍有降解酵母甘露聚糖的作用。在所實驗的四種方法中,H2O2降解法的效果最好,酵母甘露聚糖的重均分子量由76.52 kDa降低到了56.30 kDa。H2O2氧化降解是一種反應無殘毒、無污染、生產成本低、環保清潔的化學降解方法[21]。因此,在后續的研究中采用H2O2降解法。

2.2 酵母甘露聚糖H2O2降解的單因素實驗

2.2.1 溫度對甘露聚糖降解的影響 溫度是多糖H2O2氧化降解工藝中的一個重要因素。如圖2所示,在40～90 ℃范圍內,隨著反應體系溫度的升高,酵母甘露聚糖的降解程度快速增加,其重均分子量也快速降低。當溫度超過90 ℃時,酵母甘露聚糖的重均分子量幾乎不再降低。因此,適宜的反應溫度為90 ℃。

圖2 溫度對酵母甘露聚糖降解的影響Fig.2 Effect of temperature on yeast mannan degradation

圖3 H2O2濃度對酵母甘露聚糖降解的影響Fig.3 Effect of H2O2 concentration on yeast mannan degradation

2.2.3 H2O2處理時間對甘露聚糖降解的影響 如圖4所示,當H2O2處理時間在0.5～1.5 h時,隨著處理時間的延長,甘露聚糖的重均分子量隨之快速降低;當H2O2處理時間為1.5～2.5 h時,甘露聚糖重均分子量緩慢下降;當H2O2處理時間超過2.5 h時,甘露聚糖重均分子量幾乎不再下降。因此,適宜的H2O2處理時間為2.5 h。

圖4 H2O2處理時間對酵母甘露聚糖降解的影響Fig.4 Effect of H2O2 treatment time on yeast mannan degradation

圖5 糖濃度對甘露聚糖降解的影響Fig.5 Effect of yeast mannan concentration on its degradation

2.3 酵母甘露聚糖H2O2降解工藝的優化

酵母甘露聚糖H2O2降解工藝的正交優化實驗結果見表2。由表2中R值分析,影響酵母甘露聚糖降解的四個R值大小順序為:RA>RD>RC>RB,即溫度的影響最為顯著,其次是甘露聚糖濃度,H2O2濃度和反應時間相對較小。依據正交實驗結果中K值,確定制備低分子量酵母甘露聚糖的最優工藝組合為:A3B3C3D1,即溫度95 ℃、時間3 h、H2O2濃度10%、糖濃度30 g/L。對獲得的最優工藝條件進行驗證性實驗,實驗重復三次,重均分子量分別為8.09、8.07、8.06 kDa,平均分子量為8.07 kDa。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 低分子量酵母甘露聚糖的體外抗氧化活性

2.4.1 羥基自由基清除能力 羥基自由基一種重要的活性氧,在人體內主要由代謝產生,當體內產生量處于較高水平時,可引起一系列病變[22]。如圖6所示,未經降解處理的甘露聚糖(YM,76.52 kDa)、H2O2降解所制備的低分子甘露聚糖(SYM,8.07 kDa)二者的羥基自由基清除率均隨著糖濃度的增加而增大,呈濃度依賴型。

圖6 酵母甘露聚糖的羥基自由基清除能力Fig.6 The scavenging ability of yeast mannans to hydroxyl radicals

此外,還可發現SYM的·OH清除率明顯高于YM。例如,當糖濃度為2.0 g/L時,YM的·OH清除率為45.3%,而SYM的·OH清除率為61.2%,比YM高15.9%。Liu等[8]也發現低分子量靈芝多糖的·OH清除能力強于高分子量的清除能力。盡管SYM具有較好的·OH清除能力,但其·OH清除能力仍明顯低于VC。

圖7 酵母甘露聚糖的超氧陰離子自由基清除能力Fig.7 The scavenging ability of the yeast mannans to superoxide anions

3 結論