不同空氣暴露條件下四川泡菜的品質變化及產植物細胞壁降解酶微生物分析

錢 楊,吳李川,許童桐,沈秋霞,袁 洋,饒 瑜

(1.四川工商職業技術學院,四川成都 611830; 2.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039)

四川泡菜歷史悠久,以味道咸酸、口感脆生、色澤鮮亮、香味撲鼻而著稱,被稱為“川菜之骨”[1]。四川泡菜的制作是以各種新鮮蔬菜為原料,在一定鹽濃度溶液中經以乳酸菌為主的復雜微生物體系(由蔬菜和輔料等帶入)在相對封閉的池或壇中自然發酵得到[2]。而在實際生產過程中,常存在空氣滲入發酵環境的可能,空氣中的氧氣是發酵蔬菜中腐敗微生物生長的重要條件之一[3]。四川泡菜的發酵由乳酸菌主導完成,在無氧的條件下乳酸菌進行乳酸發酵,產生乳酸降低四川泡菜的pH,形成獨特的泡菜鮮香味。空氣的滲入不但對乳酸發酵無益,反而會促進某些好氧微生物的生長,造成四川泡菜中微生物菌群失衡,影響四川泡菜品質。

四川泡菜品質改變主要表現為鹽鹵pH上升、產生惡臭味和腐敗膜醭以及蔬菜軟腐等[4],其中蔬菜軟腐是由于腐敗微生物能夠分泌植物細胞壁降解酶(Plant cell wall degradation enzymes,PCWDEs),如聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶等[5],PCWDEs能夠軟化植物組織,破壞四川泡菜質構影響四川泡菜品質[6]。蔬菜軟腐一般是產PCWDEs微生物群體共同作用的結果[7],空氣暴露情況不同,四川泡菜中的微生物群體組成種類存在差異[8],導致產PCWDEs微生物種類不同,但目前尚無不同空氣暴露條件下四川泡菜中產PCWDEs微生物的相關研究。

鑒于此,本文采用發酵壇口暴露、間歇暴露和封閉三種空氣暴露程度分別模擬四川泡菜發酵過程中空氣暴露情況,以探究不同空氣暴露條件對四川泡菜發酵過程中品質的影響,并分析比較不同空氣暴露條件下產PCWDEs微生物種類的差異,以期為四川泡菜生產過程中的品質控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅皮蘿卜(約重150 g/個) 成都某菜市場;泡菜發酵菌株:植物乳桿菌E11(LactobacillusplantarumE11) 本實驗室前期分離并保藏,用于四川泡菜發酵[9],使用前由MRS培養基活化培養;鹽酸(分析純)、乙酸鈉、磷酸鈉、可溶性淀粉、CaCl2成都科龍化工試劑廠;羧甲基纖維素 西亞化工股份有限公司;木聚糖 北京索萊寶科技有限公司;多聚半乳糖醛酸 上海源葉生物科技有限公司;酵母提取物、MRS瓊脂培養基、虎紅瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(Tryptone soy,TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(Tryptone soy broth,TSB) 北京奧博星生物技術有限責任公司;Tri-HCl Amresco公司;EDTA 天津市致遠化學試劑有限公司。

TA-XT Plus質構分析儀 英國Stable Micro System有限公司;Multifuge XIR臺式冷凍離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Mastercycler ep grad PCR儀 美國Bio.Rad公司;Gel Doc EQ凝膠成像系統 美國Bio.Rad公司;DYY-2電泳儀 北京六一儀器廠;G154DWS全自動高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;pHS-3C酸度計 成都世紀方舟科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 蛋白酶(Protease)鑒別培養基:以TSA培養基為基礎,添加質量分數為1%的脫脂牛奶;淀粉酶(Amylase)鑒別培養基:以TSA培養基為基礎,添加質量分數為1%的可溶性淀粉;纖維素酶(Cellulase)鑒別培養基:以TSA培養基為基礎,添加質量分數為0.1%的羧甲基纖維素,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0;木聚糖酶(Xylanase)鑒別培養基:以TSA培養基為基礎,添加質量分數為1%的木聚糖,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0;果膠酶(Pectate lyase)鑒別培養基:以TSA培養基為基礎,添加質量分數為1%的多聚半乳糖醛酸(Polygalaconic acid,PGA),質量分數為1%的酵母提取物,0.38 μmol/L CaCl2,100 mmol/L Tri-HCl,pH8.5;聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)鑒別培養基:以TSA培養基為基礎,添加質量分數為1%的PGA,質量分數為1%的酵母提取物,2.2 mmol/L EDTA,110 mmol/L乙酸鈉,pH5.5。

1.2.2 四川泡菜制備 將新鮮紅皮蘿卜去除葉叢和須根并用清水洗凈,晾干多余水分。取約3 kg洗凈晾干的紅皮蘿卜于5 L泡菜壇中,加入3 L含鹽質量濃度為60 g/L的涼開水,涼開水中含已活化L.plantarumE11(終濃度為106CFU/mL)。隨后,分別采用發酵壇口暴露、間歇暴露和封閉三種不同空氣暴露程度進行四川泡菜發酵,以模擬不同的空氣暴露情況。具體方法如表1所示,其中每種發酵方式泡制3壇,共9壇,在50%RH空氣濕度下常溫發酵。分別在發酵的第0、8、16、32、48和64 d進行取樣用于后續分析。

表1 不同空氣暴露條件下制備四川泡菜Table 1 Preparation of Sichuan pickle under different air exposure conditions

1.2.3 pH測定 使用pHS-3C酸度計測定泡菜鹽鹵的pH。

1.2.4 微生物計數 微生物分離和計數參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》制備樣品稀釋液,選取適當的稀釋梯度涂布于培養基。TSA培養基用于細菌總數的分離和計數,MRS瓊脂培養基用于乳酸菌的分離和計數,虎紅瓊脂培養基用于霉菌和酵母菌的分離和計數。樣品涂布后平板于30 ℃恒溫培養箱培養24～48 h。

1.2.5 感官評價 不同空氣暴露條件下四川泡菜的感官評價采用綜合評分法,總分為100分,泡菜的色澤、香氣、鹽鹵狀態、膜醭狀態四個評價指標各占25分。30名參評人員均為接受過食品感官評價培訓的專業人員,男女比例為1∶1,統一采用盲評打分法進行評價,評分細則詳見表2。

表2 不同空氣暴露條件下四川泡菜感官評價評分細則Table 2 Sensory evaluation and scoring rules of Sichuan pickle under different air exposure conditions

1.2.6 質構特性測定 樣品前處理:取一整個紅皮蘿卜,將其按圖1所示均勻切分為四塊后取1～4位點為測試點,分別將各位點切分為長寬3 cm,厚2 cm的長方體使用TA-XT Plus質構分析儀P/5探頭進行質構測定。測試程序:測試前30 mm/min,測試中20 mm/min,測試后30 mm/min,壓縮量50%,圧縮力5 g。

圖1 樣品切分及測試點示意圖Fig.1 Sample segmentation and test point schematic注;1:前段,2:中心,3:后段,4:表皮。

1.2.7 產植物細胞壁降解酶微生物的分離 分別從TSA、MRS和虎紅瓊脂平板上挑取單克隆若干點種于6種產酶特性鑒別培養基上,聚半乳糖醛酸酶和果膠酶鑒別培養基于28 ℃培養24 h后觀察產PCWDEs情況,其余鑒別培養基均于30 ℃恒溫培養箱培養24 h后觀察產PCWDEs情況。其中,聚半乳糖醛酸酶和果膠酶鑒別培養基需用4 mol/L鹽酸加在菌落周圍,觀察透明區域;淀粉酶鑒別培養基需用碘液染色,觀察透明區域;纖維素酶和木聚糖鑒別培養基需用1 g/L剛果紅溶液染色15～30 min,再用1 mol/L NaCl沖洗數次,觀察透明區域;蛋白酶鑒別培養基可直接觀察透明區域[10]。

1.2.8 產植物細胞壁降解酶微生物的鑒定 分別將產植物細胞壁降解酶微生物接種于TSB培養基中,30 ℃搖床培養過夜并獲得菌懸液。使用快速提取法提取菌液中總基因組DNA[11],并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以總基因組為模板,分別利用細菌16S rDNA擴增引物1490R:5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′,Eu27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和真菌ITS擴增引物ITS4:5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′進行目的DNA的PCR擴增。前者擴增程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35個循環;72 ℃ 10 min;后者擴增程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,40 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環,72 ℃ 10 min。將符合測序條件的擴增產物送往成都擎科梓熙生物技術有限公司測序,測序結果在NCBI GenBank Database中進行BLAST比對,序列同源性≥97%時可認為是同一個屬,同源性≥98%時可認為是同一個種[12]。

1.3 數據處理

通過Origin 2018、MEGA 6.0、Clustal X、IBM SPSS Statistics 20、Excel 2007 等軟件對三個平行實驗得到的數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的pH變化分析

不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的pH變化如表3所示,在發酵的前16 d,不同空氣暴露條件下四川泡菜鹽鹵的pH都表現出相同的下降趨勢,并均在發酵第16 d降至3.0,這是由于在四川泡菜發酵前期,乳酸菌能夠消耗蔬菜中的糖類產生乳酸[13],從而導致鹽鹵中的pH下降。空氣的滲入對四川泡菜的前期發酵未造成明顯影響,但隨著發酵時間的繼續增加,暴露式發酵四川泡菜的pH開始出現明顯上升,在發酵64 d時已上升至6.5,間歇暴露式發酵四川泡菜的pH也上升至3.5,但封閉式發酵四川泡菜的pH仍維持在3.0。鹽鹵pH回升是泡菜腐敗的重要標志之一[14],暴露條件下空氣的大量滲入促進了某些真菌的生長,真菌是引起泡菜腐敗的主要微生物[15]。

表3 不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的pH變化Table 3 pH changes during the fermentation of Sichuan pickle in different air exposure conditions

2.2 不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的微生物變化分析

分析圖2可知,發酵前16 d不同空氣暴露條件下四川泡菜中的微生物數量變化趨勢基本一致。從發酵起始至第8 d,以乳酸菌為主的總菌數量增加1～2個數量級,乳酸菌數量的增加導致了泡菜鹽鹵pH的下降。第8～16 d,pH進一步降至3.0,以乳酸菌為主的總菌數量開始回落,這主要是由于低pH抑制了細菌的生長,該結果與Xiong等[16]的研究一致。從第16 d起,不同空氣暴露條件下四川泡菜中的微生物的數量開始出現差異。封閉式發酵四川泡菜中的總菌、乳酸菌和真菌的數量未出現明顯上升或下降。間歇暴露式發酵四川泡菜中總菌和真菌逐漸上升,64 d時分別達到7.73±0.38和6.69±0.33 lg CFU/mL,而乳酸菌數量與第16 d相比,下降了1個數量級。暴露式發酵四川泡菜中總菌和真菌數量從第16 d開始增加,第48 d時總菌數已高于108CFU/mL,真菌數量于64 d時達到7.60±0.38 lg CFU/mL,而乳酸菌已降至4.03±0.20 lg CFU/mL,此時真菌占暴露式發酵四川泡菜微生物的主導地位,引起暴露式發酵四川泡菜pH上升。

圖2 不同空氣暴露條件下四川泡菜 發酵過程中的微生物變化Fig.2 Microbial changes during the fermentation of Sichuan pickle in different air exposure conditions

2.3 不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的感官評價分析

不同空氣暴露條件下四川泡菜的pH從第16 d開始出現差異,發酵48 d后暴露式和間歇暴露式發酵四川泡菜出現了明顯腐敗,因此對發酵16和48 d的四川泡菜進行感官評價,評價結果見表4。封閉式發酵四川泡菜始終具有最高的評分,在整個發酵過程中,封閉式發酵四川泡菜始終具有泡菜特有的鮮香味和澄清的鹽鹵;間歇暴露式發酵四川泡菜在48 d時出現腐敗膜醭,鹽鹵出現渾濁并伴隨著輕微惡臭味;暴露式發酵四川泡菜始終具有最低的評分,在發酵16 d時雖有一定泡菜香味,但鹽鹵表面有零星腐敗膜醭出現,到發酵48 d時,暴露式發酵四川泡菜已不再具有泡菜香味,取而代之的是嚴重惡臭味,且蔬菜顏色發生改變,鹽鹵渾濁,膜醭厚重。

表4 不同空氣暴露條件下四川泡菜的感官評價Table 4 Sensory evaluation of Sichuan pickles under different air exposure conditions

2.4 不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的質構變化分析

質構是評價四川泡菜品質的重要指標之一[17]。質構的測試方法一般采用人工感官評價和質構儀檢測。質構儀可通過監測試樣的硬度、彈性、粘聚性、膠著性、咀嚼度、回復性等來反映樣品的質構變化。本研究從硬度、脆度、彈性和咀嚼性[18-19]四個方面考察不同空氣暴露程度下四川泡菜發酵過程中的質構變化。由圖3A～3D可看出,不同空氣暴露條件下四川泡菜在發酵第8 d都具有最佳的質構特性。隨著發酵時間的增加,三種空氣暴露條件下四川泡菜的質構都發生了不同程度的改變,發酵64 d后,和發酵8 d相比,暴露式發酵四川泡菜的硬度下降了93.3%,脆度下降了100%,彈性下降了4.7%,咀嚼性下降了95.8%;間歇暴露式發酵四川泡菜的硬度下降了39.1%,脆度下降了35.6%,彈性下降了4.9%,咀嚼性下降了46.9%;封閉式發酵四川泡菜的硬度下降了52.5%,脆度下降了24.4%,彈性下降了5.3%,咀嚼性下降了57.7%。到四川泡菜發酵后期,由于鹽鹵的長期浸泡和某些耐酸微生物開始生長繁殖,導致封閉式發酵四川泡菜的質構變差,此外,暴露式和間歇暴露式發酵四川泡菜由于空氣滲入,導致鹽鹵pH升高,泡菜中產PCWDEs的微生物數量增加,也進一步導致了泡菜質構變差。

圖3 不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中的質構分析Fig.3 Texture test of Sichuan pickle during the fermentations under different air exposure conditions

2.5 產植物細胞壁降解酶微生物的篩選與鑒定結果分析

微生物產植物細胞壁降解酶是造成泡菜質構發生變化的重要原因之一[4]。從涂布有不同空氣暴露程度下泡菜鹽鹵樣品的TSA培養基(發酵第48和64 d)上隨機挑取菌落各50株進行產PCWDEs分析,菌株產PCWDEs情況及鑒定結果如表5所示。不同空氣暴露條件下四川泡菜發酵過程中產PCWDEs微生物種類不同,發酵48 d時,僅在暴露式發酵四川泡菜中所挑取的50株微生物中分離得到3種共12株產PCWDEs微生物,這些微生物主要產纖維素酶。間歇暴露和封閉式發酵四川泡菜中未分得產PCWDEs微生物。

表5 不同空氣暴露條件下顯著產酶微生物的種類及產酶特性Table 5 Microbial species and their enzymatic properties from different air exposure conditions

發酵64 d后三種空氣暴露條件下的四川泡菜中均分離得到了一定數量的產PCWDEs微生物。其中暴露式發酵四川泡菜中分離得到2種共7株產PCWDEs微生物,這些微生物主要產纖維素酶、木聚糖酶和蛋白酶;間歇暴露式發酵四川泡菜中分離得到2種共6株產PCWDEs微生物,這些微生物以產聚半乳糖醛酸酶為主;封閉式發酵四川泡菜中分離得到2種共5株產PCWDEs微生物,這些微生物主要產淀粉酶。本研究分離得到產酶微生物的產酶種類與Kuge等[20-25]的研究結果一致。

對所分離得到的產PCWDEs微生物進一步分析可知,暴露條件分離得到的5種微生物中普羅威登斯菌(Providenciavermicola)、鉛黃腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為兼性好氧型微生物,產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)為專性好氧型微生物;間歇暴露條件下分離得到的土霉菌(Galactomycesgeotrichum)為好氧微生物,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為兼性好氧型微生物;封閉條件下分離得到的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)和季也蒙畢赤酵母菌(Meyerozymaguilliermondii)為兼性厭氧型微生物?？諝獾臐B入影響了四川泡菜中微生物的生長,尤其促進了暴露式發酵四川泡菜中產PCWDEs的好氧微生物生長,因此,在四川泡菜發酵過程應嚴格控制空氣的滲入。

3 結論

不同空氣暴露條件對四川泡菜的品質和產PCWDEs微生物的種類和數量均有影響。暴露式發酵四川泡菜在發酵的前16 d能夠正常完成泡菜的發酵,在發酵第8 d具有最佳質構;但隨著發酵時間增加,持續的空氣暴露導致泡菜鹽鹵pH升高,泡菜發生軟腐,發酵48 d后在隨機挑取的50株微生物中就已分得12株以產纖維素酶為主的好氧型和兼性好氧型微生物;發酵64 d后暴露式發酵四川泡菜的pH上升至6.5,真菌數量上升至7.6 lg CFU/mL,和發酵8 d相比泡菜硬度和脆度分別下降了93.2%和100%,并且新分離得到7株產纖維素酶和蛋白酶為主的產PCWDEs微生物。間歇暴露式發酵四川泡菜雖能基本維持四川泡菜的特性,但在發酵64 d后仍出現腐敗,主要表現為pH上升至3.5,和發酵8 d的最佳質構相比泡菜硬度和脆度分別下降了39.1%和35.6%,產生惡臭味和腐敗膜醭,在該條件下分離得到的6株產PCWDEs微生物多為好氧型微生物。封閉式發酵四川泡菜在整個發酵過程中都能較好的維持四川泡菜的特性,發酵64 d后鹽鹵pH仍維持在3.0,乳酸菌數量雖下降至5.34 lg CFU/mL,但仍是四川泡菜中的主導微生物,在該條件下分離得到的5株產淀粉酶的微生物多為兼性厭氧型微生物。因此,在四川泡菜的家庭制作和工業生產中都應當最大可能保證四川泡菜的封閉發酵,避免空氣滲入影響四川泡菜品質。