誘導(dǎo)發(fā)酵樺褐孔菌三萜類化合物合成及其抗氧化功能的研究

楊宏博,韓增華,楊 紅,李志如,韓建春,4,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,黑龍江哈爾濱 150010; 3.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院,黑龍江哈爾濱 150090; 4.黑龍江省綠色食品研究院,黑龍江哈爾濱 150000)

樺褐孔菌學(xué)名(Fascoporiaoblique(Pers.Fr.)Chaga)或(Inonotusobliquus(Fr.)Pilat)是一種十分珍稀且藥用價(jià)值很高的白腐真菌。其內(nèi)包含如蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、三萜、甾醇等多種活性物質(zhì)[1]。三萜類化合物是其中很重要的一種。主要以羊毛脂烷型三萜化合物為主,由于它的高藥用價(jià)值,被普遍應(yīng)用在抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗HIV等方面[2]。目前獲得樺褐孔菌三萜主要有三種方法,第一從天然樺褐孔菌中直接提取,但由于天然樺褐孔菌生長(zhǎng)遲緩,三萜含量低,所以導(dǎo)致價(jià)格昂貴[3];第二種是采用人工栽培技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)樺褐孔菌的培育,但其在技術(shù)層面上尚不完整,產(chǎn)量也偏低[4];三種為液體發(fā)酵技術(shù),此方法可以縮短生產(chǎn)周期、提高菌絲生長(zhǎng)速度,保證三萜含量穩(wěn)定、不受外界環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)[5]。但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,三萜是次級(jí)代謝產(chǎn)物,含量較低。通過(guò)對(duì)碳氮源種類、無(wú)機(jī)鹽,生長(zhǎng)因子,接種量、初始 pH、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行了優(yōu)化,以及篩選菌株和優(yōu)化不同提取條件進(jìn)行了研究[5-7]，目前許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)外源誘導(dǎo)因子在植物和生物合成化合物方面有顯著影響[8]。

外源誘導(dǎo)因子的加入可以提高代謝途徑中基因的表達(dá)量與酶的活性,能改善次級(jí)代謝產(chǎn)物合成量,具有較強(qiáng)的特異性[9]。目前,不少學(xué)者研究證實(shí)單純的優(yōu)化培養(yǎng)條件和提取工藝提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的做法效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于加入誘導(dǎo)劑[10]。目前普遍應(yīng)用的外源誘導(dǎo)因子有5種,分別為:茉莉酸甲酯(MeJA),是一種茉莉酮酸酯,同時(shí)也是一種與損傷相關(guān)的信號(hào)因子,加入到植物和真菌培養(yǎng)環(huán)境中,會(huì)誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御,促進(jìn)真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及調(diào)節(jié)某些相關(guān)基因的表達(dá)[10-11]。用MeJA處理的栽培靈芝顯示靈芝酸增加1.2倍[12]。水楊酸(Salicylic acid,SA),是分布在植物體的有機(jī)酸,可以提升植物的抗逆性和特定的抗逆基因表達(dá),來(lái)提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。王啟等[13]證實(shí)了SA可以影響有關(guān)三萜類化合物表達(dá)的基因,對(duì)三萜合成過(guò)程中部分關(guān)鍵酶表達(dá)程度有所提高,從而提高三萜產(chǎn)量。脂肪酸對(duì)細(xì)胞膜通透性有一定影響,在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)加入2%的薏苡仁油,與對(duì)照相比,生物量和三萜類化合物含量分別增加了3.34倍和2.76倍[14]。金屬離子是樺褐孔菌生長(zhǎng)必需物質(zhì),它是潛在誘導(dǎo)劑,并且可用于持續(xù)生產(chǎn)有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物[15-16]。有研究表明植物水提取物可以促進(jìn)三萜化合物的積累[17]。Wang等[18]證實(shí)來(lái)自白樺樹(shù)皮的水提物(0.01 g/L)可以顯著提高類固醇產(chǎn)量,白樺樹(shù)皮的水提取物(0.01和0.1 g/L)可以同時(shí)進(jìn)行刺激菌絲生長(zhǎng)和類固醇含量。

目前對(duì)樺褐孔菌三萜方面的研究在提取、分離方向上較多,對(duì)如何提高三萜含量以及活性分析上鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)選擇 MeJA、SA、亞油酸、Fe2+、樺樹(shù)皮水提物為誘導(dǎo)因子,研究其對(duì)樺褐孔菌誘導(dǎo)的可行性,并確定最佳誘導(dǎo)方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌 黑龍江省微生物研究所提供;茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、水楊酸(Salicylic acid,SA)、白樺脂醇、DPPH、香草醛 Sigma公司;亞油酸 拉丁試劑有限公司;Fe2(SO4)3、無(wú)水乙醇、鹽酸 天津市匯杭化工科技有限公司。

SW-CMD超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司;ZPQ-400智能氣候培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;CR-21N高速低溫離心機(jī) 日立工機(jī)株式會(huì)社;UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司制造;DK-8D電熱恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SL-16超聲波水浴鍋 江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司;0.2 μm濾膜 美國(guó)密理博有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及培養(yǎng) 將取出原始菌種在滅菌臺(tái)上鉤取1～2小塊置于準(zhǔn)備好的斜面培養(yǎng)基上27 ℃下培養(yǎng)時(shí)間為12 d左右,待菌絲布滿試管斜面,使用自制接種針接種1.5 mm×1.5 mm大小的固態(tài)菌種,接種量為10%左右,接種在含有葡萄糖30 g/L,蛋白胨4 g/L,MgSO40.5 g/L,KH2PO41.5 g/L,CaCl20.1 g/L,VB120 mg/L液體培養(yǎng)基中[19],于26 ℃和150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)8 d[20]。

1.2.2 菌絲體干重的測(cè)定 接種培養(yǎng)8 d后,用紗布過(guò)濾發(fā)酵液,用蒸餾水沖洗菌絲球數(shù)次后放于70 ℃的烘箱中,每隔2 h后取出稱重直至重量不變,此時(shí)為菌絲干重。

1.2.3 三萜類化合物的提取和測(cè)定

1.2.3.1 三萜類化合物的提取 將干燥的菌絲體用粉碎機(jī)處理,過(guò)100目篩,用10 mL異丙醇溶解0.1 g菌粉,低溫條件下超聲破壁5 min,間歇3 s后,溫度為50 ℃水浴24 h后,離心,取上層清液,補(bǔ)足至10 mL,制備成樺褐孔菌菌絲中三萜類化合物粗提液,在-10 ℃下保存[21]。

1.2.3.2 三萜類化合物的測(cè)定 采用香草醛-冰醋酸比色法測(cè)定三萜類物質(zhì)[21],用白樺脂醇的質(zhì)量為X軸,吸光值為Y軸,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=0.0015X+0.0077。

準(zhǔn)確吸取0.2 mL上述三萜類化合物粗提液,按上述1.2.3.2的方法測(cè)定,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出三萜類化合物質(zhì)量。

1.2.4 樺褐孔菌菌絲體中總?cè)屏?樺褐孔菌菌絲體中總?cè)屏考匆慌l(fā)酵培養(yǎng)液中所獲得的所有樺褐孔菌菌絲體中三萜類化合物的總量,計(jì)算公式如下:

總?cè)?mg/L)=菌絲體干重(g/L)×三萜含量(mg/g)

1.2.5 誘導(dǎo)劑的添加量及添加時(shí)間的篩選

1.2.5.1 MeJA誘導(dǎo)三萜合成的研究 以0.2%(w/w)乙醇作為助溶劑配制濃度為10、50 和 100 μmol/L的MeJA溶液,經(jīng)孔徑為0.2 μm 的濾膜過(guò)濾,在發(fā)酵第0、3、6 d將配置好的MeJA溶液加入樺褐孔菌菌絲體發(fā)酵液中,添加量為2 μL/mL,同時(shí)以空白和僅加2%乙醇的培養(yǎng)液為對(duì)照,在1.2.1條件下培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定樺褐孔菌干重及總?cè)屏俊?/p>

1.2.5.2 SA誘導(dǎo)三萜合成的研究 配制2 mg/mL SA溶液,0.2 μm濾膜過(guò)濾。分別在發(fā)酵第0、3、6 d加入不同體積的2 mg/mL SA溶液,使SA終濃度為50、100、150 mg/L,并以加入無(wú)菌水的培養(yǎng)液作為對(duì)照組。在1.2.1條件下培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定樺褐孔菌干重及總?cè)屏俊?/p>

1.2.5.3 亞油酸誘導(dǎo)三萜生物合成的研究 分別在發(fā)酵第0、3、6 d加入不同含量亞油酸,使亞油酸在發(fā)酵液中濃度達(dá)到0.5、1.0、1.5和2.0 g/L,在1.2.1條件下培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定樺褐孔菌干重及總?cè)屏俊?/p>

1.2.5.4 樺樹(shù)皮水提物誘導(dǎo)三萜生物合成的研究 取100 g樺樹(shù)皮與1 L水一起煮沸0.5 h后,經(jīng)濾紙過(guò)濾濃縮,烘干1 h,得水提物干粉,并進(jìn)行高溫殺菌。在發(fā)酵第0、3、6 d向發(fā)酵液中添加水提物干粉,使其在發(fā)酵液中達(dá)到 0.01、0.1、1、5 g/L,在1.2.1條件下培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定樺褐孔菌干重及總?cè)屏俊?/p>

1.2.5.5 金屬離子 Fe2+誘導(dǎo)三萜合成的研究 配制濃度為9 μmol/L硫酸亞鐵溶液后用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù),在121 ℃滅菌0.5 h后在發(fā)酵第0、3、6 d加入發(fā)酵液中,使發(fā)酵液中Fe2+濃度為1、3、6、9 μmol/L;在1.2.1條件下培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定樺褐孔菌干重及總?cè)屏俊?/p>

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定 將不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后的樺褐孔菌菌絲體經(jīng)1.2.3所述方法進(jìn)行提取,經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃條件下濃縮之后用錫箔紙包住,將樣品在4 ℃的低溫冰箱中儲(chǔ)存并避光。

1.2.6.1 總還原能力的測(cè)定 參照Iris等[22]的方法,吸取不同濃度的樣品溶液1.0 mL,加入濃度為0.2 mol/L體積為2.5 mL的PBS緩沖溶液隨后再加入體積為2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。將其放在50 ℃水浴中0.5 h,取出后加2.5 mL 10%的三氯乙酸,無(wú)渾濁時(shí)加2.5 mL蒸餾水,再加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵。反應(yīng)10 min后在波長(zhǎng)為700 nm時(shí)測(cè)吸光值為A1,空白以去離子水代替樣液為A0。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定總還原能力。

總還原能力=A1-A0

1.2.6.2 DPPH· 清除能力的測(cè)定 參照Ozgen等[23]的方法,吸取2.0 mL樣品溶液,加入濃度1×10-4mol/L DPPH溶液2 mL后室溫避光反應(yīng)0.5 h后在517 nm測(cè)其吸光值A(chǔ)i,無(wú)水乙醇代替樣液為A0,樣液與無(wú)水乙醇混合液吸光值為Aj。

1.2.6.3 OH·清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[24],吸取1.0 mL樣液加入等體積的濃度為10 mmol/L硫酸亞鐵溶液,再加入2.0 mL濃度為10 mmol/L雙氧水溶液混勻后靜置10 min后加入10 mmol/L水楊酸溶液1.0 mL后,37 ℃水浴0.5 h,冷卻后以4000 r/min離心5 min,在510 nm處測(cè)定其吸光度為Ai,去離子水代替樣液為A0,無(wú)水乙醇代替水楊酸為Aj。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)n次(n≥3)表示數(shù)據(jù)方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,所有數(shù)據(jù)采用spass 20.0進(jìn)行顯著性分析,P<0.05,以O(shè)rigin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)劑篩選結(jié)果

2.1.1 MeJA誘導(dǎo)樺褐孔菌三萜化合物生物合成的研究 MeJA是來(lái)源與植物體內(nèi)信號(hào)因子,作為外源添加劑可以改變代謝產(chǎn)物合成量,因此本試驗(yàn)研究了MeJA溶液對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜類化合物合成的影響,試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 MeJA對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.1 Effects of MeJA on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

從圖1結(jié)果可以看出,MeJA添加濃度與時(shí)間均對(duì)樺褐孔菌菌絲體的生長(zhǎng)及三萜類化合物的合成具有顯著影響。相同濃度下,在發(fā)酵初期加入茉莉酸甲酯菌絲含量顯著(P<0.05)低于發(fā)酵后期加入誘導(dǎo)劑,此結(jié)果與粗毛纖孔菌在發(fā)酵后期加入茉莉酸甲酯利于三萜化合物合成一致[26]。對(duì)于發(fā)酵時(shí)間的確定,在第6 d加入誘導(dǎo)劑顯著高于(P<0.05)其他組。在同一時(shí)間下,誘導(dǎo)劑溶液對(duì)菌絲量與三萜含量影響隨濃度的增加表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制,在50 μmol/L出現(xiàn)峰值。從圖1可以看出,只加助溶劑會(huì)促進(jìn)菌絲生長(zhǎng),不會(huì)增加三萜含量。在發(fā)酵期間添加MeJA時(shí),濃度對(duì)于菌絲含量的影響呈現(xiàn)在0～50 μmol/L范圍菌絲含量和三萜化合物隨濃度增加而增加,當(dāng)濃度在50～100 μmol/L時(shí)茉莉酸甲酯的加入會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)。但隨著濃度增加三萜含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(P<0.05)。在第6 d加入50 μmol/L茉莉酸甲酯可得到菌絲體的量為10.05±0.01 g/L,菌絲體中三萜含量107.72±1.07 mg/g,三萜總量為1082.19 mg/L,與不加入誘導(dǎo)劑的對(duì)照組相比三萜總量增加了119.96%。有研究顯示,MeJA可以改善鯊烯合成酶、鯊烯環(huán)氧酶、β-香樹(shù)脂合成酶等酶的基因表達(dá)活力,同時(shí)影響酶的活性。而這些酶都在合成三萜起至關(guān)重要的作用[27]。為此后續(xù)會(huì)對(duì)MeJA在哪一時(shí)間段對(duì)哪種酶基因表達(dá)量的提高進(jìn)行深入研究。三萜作為樺褐孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的一種,MeJA的加入可能會(huì)刺激樺褐孔菌的自我保護(hù)機(jī)制,從而后期加入效果會(huì)更好一些。

2.1.2 SA誘導(dǎo)樺褐孔菌三萜化合物生物合成的研究 作為存在于植物體內(nèi)的酸類的一種SA,它參與植物生長(zhǎng)過(guò)程的重要活動(dòng),同時(shí)參與植物抗病害工作。SA對(duì)樺褐孔菌的誘導(dǎo)結(jié)果如圖2所示。

圖2 SA對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.2 Effects of SA on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

從圖2得出,同一時(shí)間下菌絲體量三萜含量,總?cè)屏咳吲c濃度關(guān)系表現(xiàn)為隨濃度增加其先增加后降低,濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)到最大。同一濃度下,發(fā)酵早期加入SA會(huì)抑制菌絲體生長(zhǎng)但可以促進(jìn)三萜的合成。SA可改善苯丙氨酸裂解酶、H2O2酶等抗氧化酶的活力,提高基因表達(dá)量,從而實(shí)現(xiàn)三萜的增產(chǎn)同時(shí)也會(huì)在一定程度上影響菌絲含量[28]。所以從圖2中可以看出空白組的菌絲含量顯著高于其他組(P<0.05)。但三萜含量顯著低于其他組(P<0.05)。通過(guò)數(shù)據(jù)綜合分析得,SA誘導(dǎo)的最佳條件為濃度為100 mg/L,添加時(shí)間為第0 d,此時(shí)總?cè)屏繛?16.91 mg/L,與對(duì)照組相比提高了84.63%。

2.1.3 亞油酸誘導(dǎo)樺褐孔菌三萜化合物生物合成的研究 亞油酸是多碳長(zhǎng)鏈脂肪酸,含有2個(gè)碳碳雙鍵,無(wú)毒性,可以作為外源誘導(dǎo)因子,而且來(lái)源廣泛。本研究初次嘗試運(yùn)用亞油酸對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行誘導(dǎo)。

根據(jù)圖3可知,隨亞油酸濃度的增加,抑制了菌絲生長(zhǎng),三萜化合物含量先增加后降低。當(dāng)濃度為1.5 g/L時(shí)三萜化合物含量達(dá)到最高。隨發(fā)酵添加亞油酸時(shí)間的增加,菌絲含量與三萜含量顯著高于(P<0.05)其他組,得出發(fā)酵早期加入亞油酸不利于菌絲的生長(zhǎng)與三萜化合物的積累。過(guò)高濃度的亞油酸菌絲含量降低,可能是由于亞油酸在覆蓋在發(fā)酵液表面,降低了O2含量,從而抑制樺褐孔菌生長(zhǎng)[29]。實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有害的條件可能對(duì)三萜類化合物的形成產(chǎn)生積極影響,這與先前使用亞油酸增強(qiáng)Inonotusobliquus多酚和黃酮類化合物產(chǎn)生的研究一致[9]。綜上,效果最好條件為在第6 d添加1.5 g/L亞油酸進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵,此時(shí)總?cè)屏繛?75.58 mg/L,與對(duì)照組相比提高了56.28%。

圖3 亞油酸對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.3 Effects of linoleic acid on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

2.1.4 樺樹(shù)皮水提物誘導(dǎo)三萜化合物合成 真菌的生長(zhǎng)所需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幾乎都從寄主體內(nèi)獲得,所以將寄主樺樹(shù)皮水提物作為誘導(dǎo)因子加入培養(yǎng)液中,觀察對(duì)樺褐孔菌生長(zhǎng)的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 樺樹(shù)皮水提物對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.4 Effects of water extract from birch bark on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

由圖4可知,加入樺樹(shù)皮水提物對(duì)樺褐孔菌菌絲生長(zhǎng)有顯著影響(P<0.05),隨濃度增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),在0～1 g/L范圍內(nèi)菌絲含量與三萜化合物的含量增加,當(dāng)濃度超過(guò)1 g/L后菌絲生長(zhǎng)三萜化合物合成受到抑制。在發(fā)酵初期加入樺樹(shù)皮水提物效果明顯好于在發(fā)酵后期。當(dāng)濃度為1 g/L時(shí)第0 d添加菌絲含量達(dá)到最大值10.38 g/L，三萜化合物總量比第6 d提高了16.98%。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)結(jié)果表明,在發(fā)酵第0 d加入1 g/L樺樹(shù)皮水提物得到三萜化合物達(dá)到峰值,976.14 mg/L,與對(duì)照組相比提高了99.10%。由于目前對(duì)于樺樹(shù)皮水提物中所含物質(zhì)尚不明確,因此后續(xù)試驗(yàn)研究中進(jìn)一步揭示哪種物質(zhì)對(duì)發(fā)酵起作用。

2.1.5 金屬離子Fe2+誘導(dǎo)三萜化合物合成的研究 鐵離子對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響如圖5所示。

由圖5可知,Fe2+對(duì)樺褐孔菌三萜類化合物的合成沒(méi)有顯著影響作用(P>0.05)。但會(huì)增加菌絲體產(chǎn)量,隨著Fe2+濃度的增加,對(duì)菌絲體生長(zhǎng)呈先促進(jìn)后抑制,當(dāng)Fe2+添加濃度為0～6 μmol/L范圍時(shí)表現(xiàn)為(P<0.05),超過(guò)6 μmol/L時(shí)表現(xiàn)為抑制,當(dāng)濃度為9 μmol/L時(shí)最低。說(shuō)明Fe2+促進(jìn)樺褐孔菌生長(zhǎng)需要濃度要求[16]。而且發(fā)酵后期加入Fe2+效果弱于早期。所以,早期添加濃度為 6 μmol/L的Fe2+可使菌絲體量達(dá)到最大值,進(jìn)而達(dá)到三萜增產(chǎn)的目的,菌絲含量達(dá)到10.44 mg/L,較對(duì)照組提高了2.04%。

圖5 Fe2+對(duì)樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.5 Effect of Fe2+ on the amount of mycelium and triterpene in Birch

2.2 抗氧化活性分析

已有學(xué)者證實(shí)三萜類化合物是潛在抗氧化劑[29],為測(cè)定樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化能力,對(duì)經(jīng)過(guò)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后的樺褐孔菌進(jìn)行了測(cè)定,本試驗(yàn)測(cè)定了總還原力及多種自由基清除能力,并以VC為對(duì)照,試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

從圖6中數(shù)據(jù)結(jié)果中得出,樺褐孔菌產(chǎn)生的三萜化合物在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好,濃度與抗氧化能力成正相關(guān),此外,誘導(dǎo)因子的加入能夠有效提高抗氧化能力,但不同誘導(dǎo)因子對(duì)抗氧化能力的提升有一定差距。圖6(a)結(jié)果表明,經(jīng)SA誘導(dǎo)后的效果較好,在濃度3 mg/mL其值為1.003,比未誘導(dǎo)樺褐孔菌三萜類化合物提高了76.02%。圖6(b)結(jié)果表明,當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg/mL經(jīng)誘導(dǎo)后的樺褐孔菌三萜類化合物對(duì)DPPH·清除率變化較小,但都顯著高于未誘導(dǎo)。經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后隨濃度增加清除率提高但不顯著(P>0.05)。圖6(c)結(jié)果表明,經(jīng)誘導(dǎo)后的樺褐孔菌三萜化合物對(duì)于OH·清除效果明顯低于VC。經(jīng)SA誘導(dǎo)的樺褐孔菌三萜化合物效果最好,比未誘導(dǎo)的提高了35.06%。

圖6 不同誘導(dǎo)劑對(duì)樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化能力影響Fig.6 Effects of different inducers on antioxidant capacity of triterpenes from Inonotus obliquus

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,MeJA、SA、亞油酸、樺樹(shù)皮汁水提物和Fe2+5種誘導(dǎo)劑均能提高樺褐孔菌菌絲體中三萜含量,但方式略有不同。添加時(shí)間為第6 d添加濃度50 μmol/L的MeJA溶液誘導(dǎo)效果最為明顯,得到1082.19 mg三萜類化合物,與對(duì)照組相比提高119.96%。抗氧化能力試驗(yàn)中,本試驗(yàn)所選用的外源誘導(dǎo)因子都能增強(qiáng)樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化能力,其中MeJA表現(xiàn)突出,在其之后的為SA和樺樹(shù)皮水提物。誘導(dǎo)劑能提高抗氧化能力可能是由于增加了某些抗氧化官能團(tuán)的含量,但詳細(xì)原因需要更深入的探究。本試驗(yàn)為實(shí)現(xiàn)樺褐孔菌三萜類化合物的增產(chǎn)以及開(kāi)發(fā)新的抗氧化劑資源提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。