鴻雁雁血多肽的制備及免疫調節作用的初步研究

王 錚,趙 宇,高曉晨,孫 堯,崔本海,高 冷,*

(1.長春工業大學化學與生命科學學院,吉林長春 130012; 2.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院,吉林長春 130012; 3.通榆縣向海崔成大雁養殖有限公司,吉林白城 137200)

鴻雁(Ansercygnoides)屬鳥綱鴨科[1]。雁血可作藥用,據《本草綱目》、《日華本草》、《千金食治》、《隨息居飲食譜》等十多部藥典、食譜記載,雁血能大補五臟,養陰益氣,暖胃開津,強身健體,并且對增強機體免疫力、防癌、防“三高”等具有特殊醫療功效。

我國鴻雁人工養殖場日益增加，雁血資源豐富。血液作為肉制品行業中最大的副產品,在保存與加工方面仍存在一定困難[2],目前的應用僅限于簡單制成血制品食用,或用作飼料,大部分的血液作為廢料被丟棄[3],利用率極低,這樣既會對環境造成污染,又會浪費了寶貴的雁血資源[4]。免疫系統是疾病防御的第一道防線,如今人們的不健康生活方式導致自身免疫力下降從而引發各類疾病[5],人們可以通過食用免疫活性肽來提高自身免疫力,且無毒副作用[6]。現階段我國對雁血的研究甚少,因此對鴻雁血的特醫性食品研究及開發具有重要意義。

本研究以向海鴻雁的新鮮血液為原料,采用生物酶解技術提取新鮮雁血中的有效成分,確定最佳酶解條件,并對有效成分進行分離純化。采用SDS-PAGE電泳技術測得酶解后有效成分的分子量分布情況。本研究擬通過研究雁血多肽對小鼠脾淋巴細胞體外增殖及對IL-2、INF-γ與PGE2分泌量的影響,初步探究雁血多肽的免疫調節作用,為今后雁產品的開發及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴻雁血 吉林省白城市通榆縣向海崔成大雁養殖有限公司提供;清潔級小鼠(60只，雌雄各半),體質量18～22 g 吉林大學實驗動物中心提供(許可號:SYXK(吉)2016-0001);SephadexG-50 上海研卉生物科技有限公司;RPMI-1640培養基、胎牛血清 上海聯碩生物科技有限公司;白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)ELISA檢測試劑盒、干擾素γ(interferon-gamma,IFN-γ)ELISA檢測試劑盒、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)ELISA檢測試劑盒 上海晶抗生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(400 U/mg)、中性蛋白酶(60000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、復合蛋白酶(400 U/mg) 蘇柯漢(漲濰坊)生物工程有限公司；實驗所有試劑 均為分析純。

LQZ-211型落地式全溫振蕩器 上海精宏實驗設備有限公司;LGJ-30冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;UV-3000PC紫外可見分光光度計 杭州俊升科學器材有限公司;TGL16M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;PH-050A型恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;ReadMax1900型光吸收全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雁血多肽的酶解工藝研究

1.2.1.1 原料預處理 取新鮮鴻雁血2 L,加0.1%的檸檬酸三鈉抗凝,5000 r/min離心30 min,超聲2 h破膜,5000 r/min離心15 min,冷凍干燥得到雁血蛋白。

1.2.1.2 酶解工藝流程 雁血蛋白→蛋白酶酶解→滅酶→離心→冷凍干燥→雁血多肽

將20 g雁血蛋白溶于200 mL去離子水中,稱取一定的蛋白酶,在一定的溫度和pH下酶解一定的時間。酶解結束后,滅酶10 min,靜置冷卻,5000 r/min離心15 min,取上清液,冷凍干燥,以備后續實驗使用。

1.2.1.3 雁血多肽的蛋白酶選擇 首先選用中性蛋白酶(60000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、木瓜蛋白酶(400 U/mg)和復合蛋白酶(以上三種蛋白酶按1∶1∶1的酶活比例組成),在每一種蛋白酶的最佳酶解條件下,利用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度[7]。

1.2.1.4 雁血多肽單因素實驗 稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,調節pH到7后加入4000 U/g的復合蛋白酶,分別在30、40、50、60、70 ℃下酶解5 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,分別調節pH到6、7、8、9、10后加入4000 U/g的復合蛋白酶,在50 ℃下酶解5 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,調節pH到7后,分別加入2000、3000、4000、5000、6000 U/g的復合蛋白酶,在50 ℃下酶解5 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,調節pH到7后加入4000 U/g的復合蛋白酶,在50 ℃下分別酶解3、4、5、6、7 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度[8]。

1.2.1.5 雁血多肽響應面優化 選取影響水解度的三個因素分別為酶解溫度、pH、加酶量[9]。采用3因素3水平響應面試驗,因素與水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.1.6 水解度測定 甲醛滴定法測定氨基氮含量[10],凱氏定氮法測定樣品中總氮含量[11],按下列公式計算:

1.2.2 雁血蛋白酶解前后的分子量分布測定 配制12%分離膠和5%濃縮膠。取1 mg樣品置于1 mL蒸餾水中,取20 μL樣品溶液置于離心管中,同時加入20 μL上樣Buffer,100 ℃煮沸10 min,12000 r/min離心1 min,取10 μL上清液上樣。電泳儀電壓80 V,樣品通過濃縮膠后將電壓調至120 V。電泳結束后剝出凝膠,浸泡在考馬斯亮藍R-250染色液中,染色結束后將凝膠置于脫色液中,脫色后將凝膠進行掃描獲取圖像[12-13]。

1.2.3 雁血蛋白酶解前后免疫活性的比較

1.2.3.1 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 對小白鼠進行頸椎脫臼致死,置于75%的乙醇中浸泡5 min。在超凈工作臺中進行無菌分離脾臟,放入盛有PBS的培養皿中。取200目的細胞篩,將脾臟放于細胞篩上,切成小塊,加入適量的全血及組織稀釋液,用注射器活塞輕輕研磨脾臟,將細胞懸液立即轉移到15 mL無菌離心管中,1500 r/min離心20 min。用吸管吸出中間乳白色的淋巴細胞層置于15 mL無菌離心管中,加入10 mL的PBS洗滌,1000 r/min離心10 min棄上清液,再加入5 mL的PRMI-1640完全培養基重懸細胞,將細胞轉移至培養瓶中置于恒溫細胞培養箱備用[14]。

1.2.3.2 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗 按1.2.3.1方法制備小鼠脾淋巴細胞懸液,加入96孔細胞培養板,每孔100 μL。試驗分為空白組(每孔加40 μL的RPMI-1640);協同 ConA刺激組(各組每孔分別加入未酶解雁血與雁血酶解產物20 μL,終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL,加ConA 20 μL,ConA的終濃度為5 μg/mL),每組6個復孔。置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養45 h,每孔加 5 mg/mL的MTT溶液20 μL,培養箱繼續孵育4 h后,1000 r/min 離心5 min,棄去上清,在每孔加入150 μL二甲基亞砜,低速振蕩10 min,在570 nm波長處測定吸光度OD值[15]。

1.2.4 雁血多肽的分離純化

1.2.4.1 超濾法分離雁血多肽 通過復合蛋白酶酶解得到雁血多肽溶液,將雁血多肽溶液倒入分子量為10 kDa的超濾管中,配平后使用4 ℃離心機中,5000 r/min離心30 min,取濾膜下的液體到另一離心管中,重復3次得到分子量小于10 kDa的雁血多肽溶液[16]。

1.2.4.2 凝膠過濾層析純化雁血多肽 經超濾得到的雁血多肽溶液采用Sephadex G-50凝膠層析柱(1.6 cm×50 cm)進行分離。用去離子水對凝膠柱進行平衡,平衡120 min后上樣,上樣量為2 mL,洗脫液為去離子水,洗脫速度為0.5 mL/min,紫外檢測波長為280 nm,每隔5 min收集各峰組分。重復上述分離操作以得到足夠的雁血多肽樣品進行冷凍干燥備用[17-18]。

1.2.5 雁血多肽的免疫功能研究 按1.2.3.1的方法制備的小鼠脾淋巴細胞懸液,加入24孔培養板,每孔100 μL,空白組細胞用完全培養基常規培養,其余各組分別加入不同質量濃度的雁血多肽分離組分,使各組分的終濃度分別為 25、50、100、200 μg/L,再加入ConA使其終濃度為 5 μg/L,另設ConA單獨刺激組，每個孔加20 μL的ConA,使其終濃度為5 μg/mL，每組設6個復孔。于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養48 h,1500 r/min離心5 min,收集培養上清,-20 ℃保存,參照IL-2、IFN-γ、PEG2的ELISA檢測試劑盒說明書的方法繪制標準曲線,檢測培養上清中各細胞因子的含量[19-20]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 酶解條件的優化

2.1.1 蛋白酶的選擇結果 由表2可知,不同蛋白酶在其最佳條件下水解度最高為復合蛋白酶(28.05%),明顯高于其他蛋白酶,所以選用復合蛋白酶進行酶解實驗。

表2 不同蛋白酶在最佳條件下的水解度Table 2 Degree of hydrolysis of different proteases under optimal conditions

2.1.2 雁血多肽的單因素實驗結果 由圖1a可知,隨酶解溫度提升,水解度呈上升趨勢,當酶解溫度達到50 ℃時,水解度最高。當溫度高于50 ℃時,水解度呈下降趨勢。蛋白酶本質上是具有生理活性的蛋白質,溫度過高時蛋白質會發生變性,減少有效酶量,從而引起酶反應速率下降,使得水解度下降。因此，酶解溫度選擇為50 ℃。由圖1b可知,當pH達到7時,水解度最高。pH會直接影響酶和蛋白質分子某些解離基團的解離狀態,只有在特定的pH條件下,酶和底物蛋白質的解離基團才能處于最易于結合并轉化成產物的解離狀態。因此，pH選擇為7。由圖1c可知,當加酶量達到4000 U/g時,水解度最高。加酶量達到一定程度后,酶促反應速度達到最大,水解度不再增加。由于加酶量為300 U/g時，水解度較低，因此，加酶量選擇為4000、5000、6000 U/g。由圖1d可知,當酶解時間達到5 h時,水解度最高。隨著反應時間的增加,可參與反應的底物量減少,蛋白酶活性下降,反應速率放緩直至蛋白酶完全失活,反應幾乎停頓,水解度幾乎不再增加。由于反應時間的影響相對較小，因此選擇為5 h，后續不再優化。

圖1 雁血多肽單因素實驗結果Fig.1 Single factor tests results of Anser cygnoides blood peptide

2.1.3 雁血多肽響應面優化結果 如表3所示雁血多肽的響應面試驗設計及結果,根據各項的回歸系數建立回歸模型,二次多項回歸方程為:

表3 雁血多肽的響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface test design and results of Anser cygnoides blood peptide

Y=29.45-0.45A-0.46B-0.48C+0.28AB+0.21AC+0.27BC-1.04A2-0.82B2-0.94C2。

表4 雁血多肽響應面方差分析結果Table 4 Response surface variance analysis result of Anser cygnoides blood peptide

圖2 各因素交互作用三維響應面圖Fig.2 Three-dimensional response surface diagram of interaction of various factors

通過Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,確定最佳酶解工藝為酶解溫度46.96 ℃,pH6.61,加酶量4658.29 U/g,此時水解度為29.6839%。考慮到實驗設施的可操作性,對酶解工藝進行修正:酶解溫度47 ℃,pH7,加酶量4500 U/g,酶解時間5 h。進行3次重復實驗,水解度的平均值為29.29%，與預測值接近,說明該響應面模型是科學有效的。

2.2 雁血蛋白酶解前后的SDS-PAGE電泳

由圖3可以清晰的看出雁血蛋白酶解前后的分子量分布,泳道3～6與泳道2相比條帶數明顯減少,說明均有降解效果。其中泳道3條帶數最少,說明復合蛋白酶的效果最佳,分子量在10 kDa以下。

圖3 SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE map注:泳道1蛋白Maker(10～250 kDa); 泳道2未酶解空白組;泳道3復合蛋白酶酶解產物; 泳道4中性蛋白酶酶解產物;泳道5木瓜蛋白酶 酶解產物;泳道6堿性蛋白酶酶解產物。

2.3 雁血蛋白酶解前后對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

脾臟是機體重要的免疫器官之一,是機體進行體液免疫和細胞免疫的重要場所[21],脾淋巴細胞的增殖,可直接反應細胞免疫情況[22]。通過小鼠脾淋巴細胞增殖實驗,觀測25、50、100、200、400 μg/mL濃度水平下,雁血蛋白酶解前后對小鼠脾淋巴細胞增殖情況的影響。結果如表5所示,協同ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時,OD值均高于空白組,且呈一定量效關系。與空白組比較,在不同濃度下,雁血蛋白酶解前后均能協同ConA促進小鼠脾淋巴細胞增殖,且在200 μg/mL濃度水平下復合蛋白酶酶解產物效果最佳(P<0.01)。

表5 雁血蛋白酶解前后對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Table 5 Effects of pre-and post-hydrolysis of Anser cygnoides blood protein on proliferation of mouse spleen

2.4 雁血多肽分離純化結果與分析

圖4所示,雁血多肽經Sephadex G-50凝膠層析柱分離,250 min后得到3個明顯主峰,分別將其命名為ACP1、ACP2、ACP3。

圖4 雁血多肽的凝膠層析Sephadex G-50洗脫曲線Fig.4 Eluting curve of Anser cygnoides blood polypeptide by gel chromatography Sephadex G-50

2.5 ACP1、ACP2、ACP3對脾臟淋巴細胞分泌IL-2、INF-γ與PGE2的影響

IL-2是T細胞生長因子,能刺激其他T淋巴細胞衍生的細胞因子的合成[23]。IFN-γ可調節癌基因的表達,抑制腫瘤細胞的分裂增殖[24-25]。PGE2(前列腺素E2)是花生四烯酸經過環加氧酶催化的代謝產物,是重要的炎癥因子,與多種疾病的發生發展有關[26-27]。由表6可見,ConA組 IL-2、IFN-γ分泌水平均高于空白組,PGE2均低于空白組。ACP1、ACP2、ACP3能協同ConA促進小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ,其分泌量均高于空白組并呈一定的量效關系,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。而與空白組比較,ConA協同ACP1、ACP2、ACP3中的PGE2含量均有降低,差異具有統計學意義(P<0.01),其中3種組分多肽在100和200 μg/mL濃度下效果較好,且ACP2在100 μg/mL濃度下效果最佳。

表6 ACP1、ACP2、ACP3對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ、PGE2含量的影響Table 6 Effects of ACP1,ACP2 and ACP3 on the secretion of IL-2,IFN-γ and PGE2 by mouse spleen

3 結論

在制備雁血多肽時,確定最佳酶解工藝為酶解溫度47 ℃,pH7,加酶量4500 U/g,此時多肽水解度為29.29%,且使用復合蛋白酶酶解效果最佳;雁血蛋白酶解前后均能夠明顯促進小鼠脾淋巴細胞增殖,且在200 μg/mL濃度水平下復合蛋白酶酶解產物效果最佳;對雁血多肽進行分級洗脫,得到ACP1、ACP2、ACP3;ACP1、ACP2、ACP3能夠明顯提升IL-2、INF-γ和降低PGE2的分泌量,且ACP2在100 μg/mL濃度下效果最佳。綜上所述,雁血多肽能夠促進機體細胞免疫功能,具有一定的免疫調節性,且ACP2效果最明顯,為雁血多肽在免疫調節方面的合理應用及產品開發提供了有效的實驗數據。