柿葉總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性

秦晶晶,錢慧琴,趙 媛,魏琬絜,袁鐵峰,魏 婧

(新鄉醫學院三全學院,河南新鄉 453200)

柿科植物柿(Diospyroskaki)在我國被廣泛種植,柿葉(Persimmon Leaves)為其干燥葉,具有活血止血、生津止渴等功效,是公認的天然保健食品。研究表明,柿葉富含黃酮、三萜類、維生素類與微量元素等多種藥理活性物質[1-4],具有抗氧化、抗癌、止血、殺菌、免疫調節等作用[5-6]。作為柿葉中最主要的活性成分之一的黃酮類化合物,在抗氧化、抗菌、抗衰老和調節血壓等方面具有顯著功能[7-10],具有很高的營養保健價值。

目前,黃酮類化合物的提取方法主要有熱水提取、有機溶劑提取、超聲波和微波輔助提取以及酶解提取等[11]。Ji等[12]用正交法優化柿葉總黃酮回流提取工藝及其抗氧化研究,王蘭等[13]用響應面法優化柿葉總黃酮提取工藝,但尚未有人探討正交和響應面在確定最佳柿葉回流提取工藝中的優劣。因此為獲得最佳柿葉黃酮回流提取工藝和充分開發利用柿葉中的生物活性成分[14-18],本研究以河南新鄉延津縣的柿葉作為研究對象,采用回流提取法在單因素實驗的基礎上,考察了乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間對柿葉中總黃酮提取量的影響,并分別用正交試驗法和響應面法優化柿葉中總黃酮的提取工藝,找出最佳工藝的方法,并且在最佳工藝方法下對其清除DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基清除的能力進行初步研究,確定柿葉總黃酮抗氧化活性,以期為柿葉綜合利用和提取柿葉總黃酮作為天然食品抗氧化劑等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿子葉 采自河南省延津縣豐莊鎮秦莊村,新鄉醫學院藥學院中藥學教研室鑒定為柿科植物柿(Diospyros kaki);蘆丁對照品 購自中國食品藥品檢定研究院(批號:100080-201408);1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH) 購自東京化成工業株式會社(CAS:1898-66-4);95%乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等試劑均為分析純 購于天津市德恩化學試劑有限公司。

電子分析天平 上海象平儀器儀表有限公司;SG-4054型數控精密恒溫水浴鍋 上海碩光電子科技有限公司;KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;R206型旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;SHZ-3型循環水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠;101-8型電熱鼓風恒溫干燥箱 江蘇金壇市佳美儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柿葉總黃酮的提取 柿葉在60 ℃恒溫干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,過40目篩,得柿葉粉;稱取1.0 g柿葉粉置于圓底燒瓶中,在一定的提取溫度、乙醇液料比、乙醇濃度和提取時間的條件下進行總黃酮的回流提取,然后將得到的提取液抽濾,用95%乙醇定容至25 mL容量瓶,備用。

1.2.2 總黃酮的測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品25 mg,置于50 mL容量瓶中,加入少量95%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻即得蘆丁對照品溶液(0.5 mg/mL)。精密吸取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中,各加水至5.0 mL,分別加入5%亞硝酸鈉0.6 mL,搖勻,放6 min,加入10%硝酸鋁0.6 mL,搖勻后放置6 min,加入4%NaOH 3.0 mL,加水至刻度,搖勻后放置15 min。于506 nm波長處測定吸收度A[9],以蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸收度A為縱坐標,繪制標準曲線,y=0.0113x+0.0171，R2=0.9998。

1.2.2.2 柿葉總黃酮的測定 準確量取樣品溶液0.3 mL于10 mL比色管中,按照1.2.2.1中所述方法進行操作,按下式計算黃酮提取量。

式中:W表示黃酮提取量,mg/g;c表示根據吸光度值計算出的溶液質量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數;m表示藥材取樣量,g。

1.2.3 單因素對黃酮提取量的影響 以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間為要素因子,研究各因素對柿葉中總黃酮提取量的影響。

1.2.3.1 乙醇濃度 按1.2.1方法,固定料液比為1∶50 (g/mL),提取溫度為60 ℃,提取時間為60 min,考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.3.2 提取溫度 在上述優化乙醇濃度的基礎上,固定乙醇濃度50%,料液比為1∶50 (g/mL),提取時間為60 min,考察提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.3.3 料液比 在上述優化乙醇濃度和提取溫度的基礎上,固定乙醇濃度50%,提取溫度為60 ℃,提取時間為60 min,考察料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)對柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.3.4 提取時間 在上述優化乙醇濃度、提取溫度和料液比的基礎上,固定乙醇濃度50%,提取溫度為60 ℃,料液比為1∶60 (g/mL),考察提取時間(40、60、80、100、120、140 min)對柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.4 正交試驗設計 為了獲得以乙醇作為溶劑,回流提取柿子葉總黃酮的最佳工藝條件,在單因素實驗結果基礎上,以柿子葉總黃酮提取量為考察指標,進行 L9(34)正交試驗,具體因素與水平設計見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素與水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 響應面試驗設計 在單因素實驗結果基礎上,按照Box-Benhnken中心組合試驗設計原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗。本實驗以總黃酮提取量為響應值,選取乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)四因素三水平進行試驗設計,因素水平見表2。

表2 因素水平編碼Table 2 Code of factors and levels

1.2.6 柿葉總黃酮體外抗氧化試驗

1.2.6.1 柿葉總黃酮對DPPH自由基清除活性的測定 將正交試驗(乙醇濃度為40%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶50 (g/mL)和提取時間為120 min)得到的柿葉總黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質量濃度分別為0.002、0.006、0.008、0.010、0.014、0.016、0.03、0.05 mg/mL的樣品溶液。參考文獻[18]進行DPPH自由基清除活性的測定,并以抗壞血酸作為參照比較效果,按以下公式計算清除率及IC50。

式中：A樣品為DPPH溶液+柿葉黃酮提取液的吸光度值;A空白為無水乙醇+柿葉黃酮提取液的吸光度值;A對照為DPPH溶液+無水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 柿葉總黃酮對羥自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到的柿葉總黃酮濃縮液加無水乙醇配制成質量濃度分別為0.002、0.006、0.008、0.03、0.05、0.10、0.60、0.80 mg/mL的樣品溶液。參考文獻[18-20]進行羥自由基清除活性測定,同時與抗壞血酸對比,按以下公式計算清除率及IC50。

式中：A樣品為2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 柿葉黃酮提取液+2.00 mL 6 mmol/L H2O2+2.00 mL 6 mmol/L水楊酸的吸光度值;A空白為2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 柿葉黃酮提取液+2.00 mL 6 mmol/L 蒸餾水+2.00 mL 6 mmol/L水楊酸的吸光度值;A對照為2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 蒸餾水+2.00 mL 6 mmol/L H2O2+2.00 mL 6 mmol/L水楊酸的吸光度值。

1.2.6.3 柿葉總黃酮對超氧自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到的黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質量濃度分別為0.01、0.03、0.06、0.12、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的樣品溶液。采用鄰苯三酚自氧化法,參考文獻[21-23]進行超氧自由基清除活性測定并與抗壞血酸作比較,按以下公式計算清除率及IC50。

式中：A樣品為2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8)+1 mL柿葉黃酮提取液+0.2 mL經37 ℃預熱過的7.0 mmol/L鄰苯三酚+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值;A空白為2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8)+1 mL蒸餾水+0.2 mL經37 ℃預熱過的7.0 mmol/L鄰苯三酚+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值;A對照為2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8)+1 mL柿葉黃酮提取液+0.2 mL蒸餾水+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值。

1.3 數據處理

采用SPASS 20.0、Design-Expert 8.0.6、Microsoft Excel 2007進行實驗數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同乙醇濃度對柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖1可知,黃酮提取量隨乙醇濃度遞增呈先增加后減少的變化趨勢,在乙醇濃度為50%時,總黃酮的提取量達到最大值,為16.11 mg/g。這可能的原因是:一方面,根據相似相溶的原理,極性越接近,溶解度越大,在乙醇體積分數為50%時,溶劑的極性和黃酮的極性最為接近,另一方面當乙醇濃度過高時,一些醇溶性雜質成分溶出量增加,反而導致黃酮類化合物的提取量下降。因此,選擇乙醇濃度40%～60%進行優化實驗。

圖1 不同乙醇濃度對柿葉黃酮提取量影響Fig.1 The effects of ethanol concentration on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.2 不同提取溫度對柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖2可知,隨提取溫度的升高,柿葉黃酮提取量先升高后下降,在60 ℃時,總黃酮的提取率達到最大值,為13.67 mg/g,可能是由于當溫度升高時,柿葉黃酮在乙醇溶液中溶解度升高,因而提取量增加,但是溫度過高時,部分黃酮類化合物結構不穩定,會分解,從而導致黃酮提取量降低。因此,選擇50～70 ℃進行優化實驗。

圖2 不同溫度對柿葉黃酮提取工藝影響Fig.2 The effects of extraction temperature on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.3 不同料液比對柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖3可知,隨著料液比的增加,黃酮提取量逐漸增大,當料液比大于1∶60 (g/mL)之后,黃酮提取量增速平緩。其主要原因是當料液比大于1∶60 (g/mL)后,黃酮大部分已經溶出,其次,隨著提取液所占比例的進一步增加,大量雜質溶出,黃酮提取量緩慢降低,故提取量不再急劇增加。為節約提取成本,因此選擇料液比為1∶50～1∶70 (g/mL)進行優化實驗。

圖3 不同料液比對柿葉黃酮提取工藝影響Fig.3 The effects of material-liquid ratio on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.4 不同提取時間對柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖4可知,提取時間在40～100 min 內總黃酮提取得量不斷增大,在提取時間100 min 時,柿葉總黃酮的提取量接近最大值,為15.39 mg/g;當繼續延長提取時間,提取量不再明顯增大,其原因可能是黃酮類化合物基本達到飽和,不再明顯溶出。因此選擇提取時間80～120 min進行優化試驗。

圖4 不同提取時間對柿葉黃酮提取工藝影響Fig.4 The effects of extraction time on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.2 正交試驗結果分析

由表3可知,R值越大,說明該因素的水平變動對試驗結果的影響越大,影響柿子葉黃酮提取四個因素順序為料液比(C)>提取溫度(B)>乙醇濃度(A)>提取時間(D)。方差分析表4顯示,乙醇濃度和料液比對黃酮提取量的影響存在統計學差異(P<0.05),而提取溫度對黃酮提取量的影響無統計學差異(P>0.05)。綜合考慮黃酮的最佳提取工藝條件組合為A1B1C1D3,即乙醇濃度為40%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶50 (g/mL)和提取時間為120 min。根據最佳條件進行驗證實驗,總黃酮平均提取量為18.11 mg/g,相對標準偏差(RSD)為0.69%,總黃酮提取量較高,重現性較好,表明此提取工藝穩定合理。

表3 正交試驗結果直觀分析Table 3 Visual analysis of orthogonal experiment results

表4 方差分析結果Table 4 Variance analysis results

2.3 Box-Behnken響應面法實驗結果與分析

2.3.1 響應面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken的中心原理為依據,以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)為自變量,總黃酮提取量為因變量,采用四因素三水平響應面優化提取工藝,利用統計學分析軟件Design-Expert 8.0.6建立數學回歸模型,確定柿葉最佳提取工藝條件,結果見表5。獲得回歸模型方程如下:Y=12.96+0.017A+0.85B-1.25C-0.069D-0.14AB+0.13AC+0.18AD+0.46BC-0.69BD-0.062CD-0.84A2-0.62B2-1.08C2+0.30D2,式中:Y為總黃酮提取量(mg/g)。

表5 響應面試驗結果及分析Table 5 Results and analysis of response surface experiment

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由4個影響因素的F值大小可以得出,各因素對柿子葉總黃酮提取量的影響順序為:

料液比>提取溫度>乙醇濃度>提取時間,料液比對柿子葉總黃酮提取量有較大影響。模型一次項D與交互項AB、AD、BC、BD、CD差異不顯著(P>0. 05),一次項A、并互項AC對柿子葉總黃酮提取量具有顯著影響(P<0.05),一次項B、C以及二次項A2、B2、C2、D2對柿子葉總黃酮提取量均有極顯著的影響(P<0.01)。

2.3.2 響應面交互作用分析與優化 響應曲面坡度越陡峭,說明響應值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,該因素的改變對響應值的影響也就越小,各因素交互作用對柿葉中總黃酮提取量影響的響應曲面以及等高線如圖5所示。在有交互作用的影響下,乙醇濃度和料液比對柿葉總黃酮的提取的交互影響作用顯著,而提取時間和提取溫度、乙醇濃度和提取時間、乙醇濃度和提取溫度、料液比和提取溫度、料液比和提取時間交互影響作用不顯著,這與表6中交互項P值的分析一致。

圖5 各因素交互作用總黃酮提取量的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of total flavonoids

2.3.3 最佳提取條件的確定及驗證 通過軟件對二次多項式回歸方程進行分析預測,乙醇回流提取柿葉總黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇濃度為47.63%,提取溫度為50.0 ℃,提取時間為120.0 min,料液比為 1∶65.97 (g/mL)。綜合考慮將其最佳工藝條件調整為乙醇濃度50%,提取溫度為50 ℃,提取時間為120 min,料液比為 1∶60 (g/mL),以此條件下對建立的數學模型進行驗證試驗,獲得的柿葉總黃酮的實際測得值為(18.21±0.01) mg/g,預測值為18.12 mg/g,預測誤差為0.51%,小于3%,因此,證實了預測值的準確可靠。

2.4 柿葉總黃酮體外抗氧化活性

2.4.1 柿葉總黃酮對 DPPH·清除作用 不同濃度的柿葉總黃酮溶液、對照品抗壞血酸溶液對DPPH自由基清除率結果見圖6。在濃度0.002～0.05 mg/mL范圍內其清除能力隨總黃酮濃度的升高而加強,當濃度增加為0.03 mg/mL,清除率達到91.47%,此后其清除率基本趨于平衡。根據SPSS20.0軟件數據分析,得到柿葉總黃酮IC50為8.0 μg/mL和抗壞血酸的IC50為11.0 μg/mL,可見,柿葉總黃酮對DPPH自由基清除率明顯高于抗壞血酸。

圖6 不同濃度的柿葉和抗壞血酸 對DPPH自由基的清除率Fig.6 DPPH· scavenging activities of VC and total flavonoids

2.4.2 柿葉總黃酮對·OH的清除作用 由圖7可知,在選定濃度0.002～0.6 mg/mL范圍內其清除能力隨總黃酮濃度的提高而增強,當濃度增加到0.6 mg/mL,清除率達到91.18%,此后其清除率增加不明顯,基本趨于平衡。根據SPSS20.0軟件數據分析,得到柿葉總黃酮IC50=18.0 μg/mL和抗壞血酸的IC50=25.0 μg/mL,這說明在相同濃度下,柿葉總黃酮對·OH清除率比抗壞血酸略強。

圖7 不同濃度的柿葉總黃酮和抗壞血酸對·OH的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of ascorbic acid and total flavonoids

圖8 不同濃度的柿葉總黃酮和抗壞血酸對 的清除率 scavenging activities of ascorbic acid and total flavonoids

3 結論

正交試驗設計的最佳提取工藝為:乙醇濃度為40%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶50 (g/mL)和提取時間為120 min,總黃酮提取量為18.11 mg/g。響應面法的最佳提取工藝為:乙醇濃度為50%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶60 (g/mL)和提取時間為120 min,總黃酮提取量為18.21 mg/g。響應面法總黃酮提取量比正交試驗法提高了0.55%。兩種方法得到的結論也是基本一致的:料液比對總黃酮含量影響顯著,各因素對總黃酮含量的影響順序為料液比>提取溫度>乙醇濃度>提取時間,而且兩法所得最佳工藝參數中,提取溫度和時間一致,正交試驗法所得乙醇濃度(40%)和料液比(1∶50 g/mL)低于響應面法的乙醇濃度(50%)和料液比(1∶60 g/mL),從經濟角度考慮,低乙醇濃度和低料液比能節約成本和能耗,而兩者提取率幾乎沒有差別。因此,正交試驗法更適合柿葉總黃酮提取工藝。

體外抗氧化活性研究表明,柿葉總黃酮對DPPH·、羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為:8.0、18.0、76.0 μg/mL,具有較強的體外抗氧化活性,為其在食品、藥品等領域開發天然抗氧化劑提供一定的理論依據。