支氣管肺泡灌洗液應用TB-LAMP對菌陰肺結核的診斷價值

陳 霞，張建勇，趙建軍

(遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科呼吸二病區，貴州 遵義 563000)

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染病，其中以肺結核最常見，最主要的傳播途徑是經呼吸道傳播[1]。根據我國實行的結核病分類標準(WS196-2017)[2]將肺結核分為原發性肺結核，血行播散性肺結核，繼發性肺結核，氣管、支氣管結核，結核性胸膜炎。近年來，由于糖尿病和獲得性免疫缺陷綜合征發病率的增高，移民和流動人口的數量增加，多種耐藥肺結核患者的增多以及許多地區和國家對結核病控制的無視等因素，導致全球結核病形勢非常嚴峻[3-4]。根據中國疾病預防控制中心的數據統計，每年肺結核報告數位于國家法定甲、乙類傳染病的前列[5]。因此，肺結核的預防與控制成為我國首要的公共衛生問題之一。目前，由于痰涂片抗酸染色檢測陽性率低，以及痰培養法檢測時間長、靈敏度低等缺點，肺結核的診斷困難，其中約70%為菌陰肺結核(3次痰涂片均陰性且痰培養陰性)，因此，肺結核漏診、誤診等情況容易在臨床上出現，更使得結核病的控制成為難題[6]。而怎樣提高菌陰肺結核的陽性診斷率，成為臨床醫生日益關注的問題。近年來越來越多的研究表明，結核分枝桿菌環介導等溫擴增技術(tuberculosis loop-mediated isothermal amplification， TB-LAMP)在結核病的診斷方面取得了良好效果，使得TB-LAMP成為了目前結核分子檢測的有效工具之一[1,7]。故通過收集某院臨床確診菌陰肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，分別應用TB-LAMP和GeneXpert MTB/RIF技術對BALF進行MTB的檢測，評估不同方法LAMP在菌陰肺結核中的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集某院2017年12月—2018年11月臨床確診為菌陰肺結核的患者254例。菌陰肺結核最終診斷參照《中國結核病防治規劃實施工作指南(2008版)》涂陰肺結核的診斷標準及中華人民共和國衛生行業標準《肺結核診斷》WS 288-2017。研究對象納入標準：(1)患者年齡為13～80歲；(2)所有患者3次痰找抗酸桿菌(即時痰、夜間痰、晨痰)均為陰性且1次痰培養陰性。254例患者在行支氣管鏡檢查前均未行抗結核治療，均在簽署支氣管鏡檢查知情同意書后行支氣管鏡檢查，在病變部位進行支氣管肺泡灌洗，收集BALF標本254份。BALF標本隨機分為2組(LAMP組、GeneXpert組)，分別采用TB-LAMP、GeneXpert MTB/RIF技術進行MTB核酸檢測，然后對所有患者進行涂片抗酸染色和羅氏培養，收集資料進行統計學分析。本研究均在醫院倫理委員會監管下完成。

1.2 儀器與試劑 由榮研生物科技有限公司提供TB-LAMP檢測試劑盒及恒溫擴增儀，由美國Cepheid 公司提供GeneXpert MTB/RIF 檢測試劑盒，由中國珠海貝索生物技術有限公司提供抗酸染色液試劑盒，所有羅氏培養的培養基均按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》制備。所有試劑均在有效期內使用。

1.3 研究方法

1.3.1 涂片抗酸染色 將支氣管鏡刷檢物進行涂片，待其自然干燥后使用苯酚復紅染液染色，5 min后用流水沖洗染色液，瀝干水分后滴入脫色液，等待1 min后再滴加亞甲藍溶液染色30 s，最后水洗干燥后進行鏡檢。

1.3.2 羅氏培養 將BALF樣本中加入等體積的4.0%NaOH溶液，振蕩搖勻后室溫靜置10 min，取沉淀1 mL接種到酸性羅氏斜面培養基上，使用37℃培養箱孵育，連續8周觀察MTB生長情況，8周后未見MTB生長則為陰性。若酸性羅氏斜面培養基上見菌落生長，則需進一步行抗酸染色檢測，檢測結果為陽性時，再采用對硝基苯甲酸 (PNB)鑒定菌落為非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium，NTM)還是MTB[8]。

1.3.3 TB-LAMP BALF樣本3 000 r/min離心15 min，棄上清液，取其沉淀30 μL用于TB-LAMP檢測，按照LAMP試劑盒操作流程進行檢測，40 min后由儀器自動判讀結果。

1.3.4 GeneXpert MTB/RIF BALF樣本3 000 r/min離心20 min，棄上清液，取其沉淀1 mL用于GeneXpert MTB/RIF技術檢測，按照GeneXpert MTB/RIF檢測操作流程進行檢測，2 h后觀察結果。

1.4 統計方法 應用SPSS 21.0進行統計學分析，計量資料采用百分比描述，不同方法間配對計數資料的比較采用McNemar檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 共收集254例菌陰肺結核的患者，其中男性146例，女性108例，平均年齡為(49.04±17.18)(13～80)歲。LAMP組共96例，其中男性53例，女性43例，平均年齡為(50.23±16.57)(13～79)歲。GeneXpert組共158例，其中男性93例，女性65例，平均年齡(48.32±17.50)(13～80)歲。兩組患者性別及年齡比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。

2.2 LAMP組涂片抗酸染色、羅氏培養、TB-LAMP檢測結果 對LAMP組96例菌陰肺結核患者均進行涂片抗酸染色、羅氏培養、TB-LAMP，陽性率分別為4.17%(4/96)、18.75%(18/96)、52.08%(50/96)，其中4例涂片抗酸染色陽性患者中羅氏培養均陽性。TB-LAMP與涂片抗酸染色、羅氏培養MTB檢測陽性率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 TB-LAMP與涂片抗酸染色、羅氏培養MTB檢測結果比較(例)

2.3 GeneXpert組涂片抗酸染色、羅氏培養、GeneXpert MTB/RIF檢測結果 對GeneXpert組158例菌陰肺結核患者均進行涂片抗酸染色、羅氏培養、GeneXpert MTB/RIF，MTB檢測陽性率分別為3.80%(6/158)、12.66%(20/158)、54.43%(86/158)，其中6例涂片抗酸染色陽性患者中羅氏培養均陽性。GeneXpert MTB/RIF與涂片抗酸染色、羅氏培養MTB檢測陽性率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 GeneXpert MTB/RIF與涂片抗酸染色、羅氏培養MTB檢測結果(例)

2.4 TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF檢測結果比較 TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF對菌陰肺結核患者檢出MTB陽性率分別為52.08%、54.43%，兩種方法陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=0.13，P>0.05)。見表3。

表3 TB-LAMP與 GeneXpert MTB/RIF MTB檢測結果比較(例)

3 討論

眾所周知，我國是全世界結核病高發國家之一。根據2018年WHO估計，全世界約有1 000萬新發結核病患者，我國新發結核病患者約88.9萬，約占全世界病例數的9%，而各地區結核病發病率存在明顯差異，其中以農村區域為主；另外，結核病在全球疾病死因中占第9位，也是單一病原體感染造成死亡的首要原因之一，造成死亡人數高于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染/艾滋病[6]。因此，提高結核病快速診斷方式以及有效控制結核病的傳播是治療結核病的關鍵[9]。目前在基層結核病診療機構中，以痰涂片抗酸染色以及痰MTB培養作為診斷肺結核的主要依據[10]，但涂片抗酸染色找MTB的陽性率約20%，痰MTB培養陽性率約30%[11]，且MTB培養耗時長，一般需要4～8周，無法滿足結核病快速診斷的要求。因此，對于我國這樣的發展中國家，簡單快速、高效經濟的結核病檢測方法在臨床中具有重要意義。

LAMP是由Gelaw等[12]發現的一種新型核酸擴增技術，該技術的引物組由兩個外部(F3和B3)引物、兩個內部引物(前向內部引物FIP和向后內部引物BIP)和環狀引物(環向前和環向后)組成，四個不同特異性的引物結合到六個不同區域的靶基因使其具有很高的特異性。LAMP反應可以簡單地在等溫條件下進行高效的鏈置換DNA聚合酶反應，通過鏈置換DNA合成的自我循環使靶序列長度在300 bp以內，最后形成不同長度的莖-環結構的DNA鏈，使其具有高靈敏度。LAMP技術具有高效性是由于雙鏈DNA的擴增不需要預先熱變性，核酸反應均可在1 h內完成且產物可以擴增至109倍[13-15]。最后，可以通過目測其熒光顏色和/或濁度的變化來判讀結果，而不需要凝膠電泳或其他檢測儀器標記的探針，且TB-LAMP技術全程均使用封閉系統，從而最大限度地降低了污染的風險。

本研究中254例菌陰肺結核患者行支氣管檢查取支氣管鏡刷檢物或BALF標本進行涂片抗酸染色、羅氏培養、TB-LAMP或GeneXpert MTB/RIF檢測，結果顯示，在臨床診斷為菌陰肺結核的254例患者中，涂片抗酸染色陽性10例(陽性率為3.94%)，羅氏培養陽性38例(陽性率為14.96%)，其中10例涂片抗酸染色陽性患者的羅氏培養均為陽性；由此可見，臨床上考慮可疑菌陰肺結核患者可以進一步行支氣管檢查取支氣管鏡刷檢物或BALF標本，進行涂片抗酸染色及MTB羅氏培養，以提高菌陰肺結核的診斷率。254份BLAF標本隨機分為兩組(LAMP組、GeneXpert組)，在LAMP組96例患者中，TB-LAMP MTB檢測陽性率為52.08%，其中4例涂片抗酸染色陽性患者中TB-LAMP均陽性；18例羅氏培養陽性患者中有1例TB-LAMP陰性，導致羅氏培養陽性而TB-LAMP陰性的原因考慮與LAMP操作人員采集標本部位以及標本量相關[16]。

本研究菌陰肺結核患者進一步行涂片抗酸染色、羅氏培養、TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF MTB檢測陽性率分別為3.94%(10/254)、14.96%(38/254)、52.08%(50/96)、54.43%(86/158)。因此，菌陰肺結核患者行支氣管鏡肺泡灌洗采集BALF標本，做涂片抗酸染色、羅氏培養、TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF檢測均可以提高結核病的診斷率。相關研究[17]指出，通過支氣管鏡獲得的支氣管鏡刷檢物標本或BALF標本對其進行涂片抗酸染色或MTB羅氏培養陽性率高于痰標本陽性率，且對結核病診斷的靈敏度有所提高，本研究結果與此一致。由WHO推薦的新型結核分枝桿菌快速檢測方法GeneXpert MTB/RIF檢測技術，通過熒光定量核酸擴增方法檢測MTB利福平耐藥基因rpoB的81 bp耐藥核心區是否發生突變，可以在快速檢測MTB同時還可以檢測利福平耐藥[18]。本研究通過對TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF技術進行比較，評估TB-LAMP的效能，研究結果顯示TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF MTB檢出陽性率分別為52.08%、54.43%，兩者比較，差異無統計學意義(P>0.05)，與陳伊等[19]研究結果相同。

與涂片抗酸染色相比，首先TB-LAMP不需要通過專業技術人員進行鏡檢，其次靈敏度及特異度均高于涂片抗酸染色，最重要的是還可以區分MTB與NTM[20]；與羅氏培養相比較，TB-LAMP陽性率高于羅氏培養，而且TB-LAMP具有檢測過程操作簡單、快速等優點；與GeneXpert MTB/RIF相比，TB-LAMP是一種等溫DNA擴增技術，不需要提供專門的核酸擴增設備，同時也不需要高難度的技術支撐，并且在檢測設備費用及設備環境要求方面均較低，從而給發展中國家或地區的結核病防治減輕壓力[21]。因此， TB-LAMP為結核病的快速高效診斷提供了替代方法，對于臨床診斷肺結核有重要意義。但TB-LAMP在檢測MTB利福平耐藥方面欠缺，因而僅能用于對低風險耐藥結核患者進行檢測[22]，在臨床工作應用中有一定的不足。

另外，近年來越來越多的研究報道TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF技術在痰標本檢測中的應用，也取得了良好的效果[20,23]，但通過BLAF標本行TB-LAMP檢測MTB目前仍缺乏進一步探究。本研究發現在臨床診斷的菌陰肺結核患者中，TB-LAMP陽性率明顯高于涂片抗酸染色以及羅氏培養，且與GeneXpert MTB/RIF檢測具有一致性，可為臨床上結核病的診斷提供新方法，值得在臨床中進一步推廣應用。