多糧和桑葚固液分離發(fā)酵保健酒的開發(fā)研究

周曉龍，張金修，劉新利

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250353；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250353；3.山東金氏紅高粱酒業(yè)公司，山東濟(jì)南 250353）

中國(guó)傳統(tǒng)工藝釀制的白酒因酒精度過(guò)高、營(yíng)養(yǎng)成分少等原因被新一代消費(fèi)者質(zhì)疑，他們逐漸傾向柔和低度、營(yíng)養(yǎng)的飲品，對(duì)酒類產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值訴求越來(lái)越強(qiáng)烈[1]；研究表明，桑葚果酒對(duì)人體健康有益[2]，但果酒的風(fēng)味和低酒精度，不具有白酒諸香協(xié)調(diào)、酒體醇厚綿柔的特點(diǎn)而受冷落；因此，如何讓白酒既能保留獨(dú)特風(fēng)格又能滿足人們對(duì)健康的需求。我們開發(fā)了桑葚發(fā)酵酒和蒸餾酒混合飲品，取名桑葚紅高粱印象酒。

桑葚在我國(guó)種植面積十分廣泛，含有較豐富的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等，是一種具有代表性的高營(yíng)養(yǎng)水果。但在自然環(huán)境下，桑葚保質(zhì)期很短，具有不耐貯運(yùn)、易受破損和雜菌污染等特點(diǎn)，桑葚如果短期沒(méi)有及時(shí)銷售或進(jìn)行深加工，會(huì)給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重影響桑葚的利用價(jià)值。鮮桑葚中含有多糖、游離酸、粗纖維、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等[3-5]。經(jīng)過(guò)發(fā)酵的桑葚果酒具有較高的花青素含量，其抗氧化活性隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增大[6]。白藜蘆醇是桑葚中最主要的活性物質(zhì)，是抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑[7-9]，具有抗菌、護(hù)肝腎及免疫調(diào)節(jié)作用[10-11]，能有效地清除各類自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[12-13]。關(guān)于提取的白藜蘆醇有許多研究，而我國(guó)也已經(jīng)將白藜蘆醇提取物應(yīng)用于美容、減肥的天然保健品中[14-15]。

綜合這些因素，本文研發(fā)出一種固液發(fā)酵結(jié)合的桑葚加高粱白酒保健酒，合理利用桑葚中的活性物質(zhì)，為研發(fā)符合現(xiàn)代健康理念的蒸餾酒提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原材料：佳木斯生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)紅高粱，越南產(chǎn)晚季糯米，夏津金黃小米、桑葚、小麥，中溫大曲和紅米曲。

酒樣：桑葚果釀造酒、白酒1 是按照?qǐng)D1 中發(fā)酵工藝釀制而成的白酒，白酒2 是市售某品牌的相近工藝同等次的清香型白酒。

試劑：無(wú)水乙醇、甲醇、乙腈（均為色譜純）、乙酸、鹽酸（≥36 %）、苯酚、氮?dú)猓兌?9.9 %）、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥96%）、乙酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品。以上試劑均購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：L-20AT 高效液相色譜High Performance Liquid Chromatography，島津制作所；L-8900Basic 氨基酸分析儀,日本東京日立高科技科技公司；GC-IMS 氣相-離子遷移譜G.A.S Flavour-Spec?Ion Migration Spectrum，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；5840R 高速冷凍離心機(jī)High speed homogenizera，艾本德中國(guó)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇的測(cè)定

白藜蘆醇的標(biāo)品制備：準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，使用甲醇溶液溶解并定容至10 mL，即為500 mg/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液，然后將標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋至0.5 mg/L、1 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、7.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，做白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。酒樣中白藜蘆醇的測(cè)定見參考文獻(xiàn)[16]植物源性食品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測(cè)定：NY/T2641—2014。

樣品制備：稱取20 g 酒樣于100 mL 離心管，加入10 mL 無(wú)水乙醇混勻，于4000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL 的容量瓶中，樣品殘?jiān)?0 mL無(wú)水乙醇提取2次后合并提取液，無(wú)水乙醇定容至50 mL，搖勻過(guò)0.45μm 濾膜待測(cè)。

1.2.2 氨基酸的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別稱取單個(gè)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品于同一燒杯中，用8.3 mL 的6 mol/L 鹽酸溶液溶解，精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，制成氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加pH2.2 檸檬酸鈉緩沖液定容至刻度，混勻?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)上機(jī)液。

樣品的制備：將桑葚果酒、桑葚保健酒、白酒1號(hào)和白酒2 號(hào)通過(guò)茚三酮粗測(cè)，過(guò)0.45 μm 濾膜后取500μL 放入液相進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。游離氨基酸的測(cè)定見參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.3 四大酯類物質(zhì)的測(cè)定

本文主要對(duì)白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯四大酯類測(cè)定，其方法見參考文獻(xiàn)[18]。

1.3 氣相離子遷移譜（Gas-ion mobility spectrometry）分析

檢測(cè)方法：取1 mL 酒樣，加9 mL 水稀釋，裝入20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，80 ℃孵化10 min，經(jīng)頂空進(jìn)樣用氣相離子遷移譜儀FlavourSpec?進(jìn)行測(cè)試。分析條件參數(shù)見表1、表2、表3。

表1 氣相-離子遷移譜單元分析條件參數(shù)

表2 自動(dòng)頂空進(jìn)樣條件參數(shù)

表3 氣相色譜條件

1.4 原料選取和工藝流程

1.4.1 原料分析

選用蛋白質(zhì)偏高的原料，可增加酒中多元醇、α-聯(lián)酮類物質(zhì)和芳香族物質(zhì)的含量；糯米總淀粉含量76.98 %，其中支鏈淀粉含量高達(dá)76.42 %，支鏈淀粉能更好的鎖住水分，固態(tài)發(fā)酵淋漿少，釀出的酒體具有綿長(zhǎng)、軟甜特點(diǎn)；桑葚經(jīng)檢測(cè)鮮果含糖量21%，含18 種氨基酸，氨基酸總量為7.188%；小麥中含有阿魏酸，在微生物的作用下生成香草醛、香草酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚。采用中溫大曲、紅米曲等多曲共同雙邊發(fā)酵，可加強(qiáng)糖化發(fā)酵能力和酯化能力，提高出酒率和蒸餾酒的品質(zhì)。通過(guò)表4 實(shí)驗(yàn)證明，選取5%的桑葚添加量為宜。工藝采用混曲雙邊發(fā)酵，將中溫大曲和紅米曲混合，可以提高糖化力和酯化力，釋放出更多風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵蒸餾階段再次將原料中養(yǎng)生因子溶入酒中，提高蒸餾酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表4 桑葚添加量和工藝參數(shù)對(duì)出酒率的影響

1.4.2 工藝流程

工藝流程圖見圖1 和圖2。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇含量分析

實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜HPLC（High Performance Liquid Chromatography）測(cè)定標(biāo)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后檢測(cè)酒樣中白藜蘆醇含量。白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，含量對(duì)比見表5。

表5 酒樣中白藜蘆醇的含量對(duì)比

根據(jù)表5 數(shù)據(jù)，桑葚保健酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯優(yōu)于白酒1 和白酒2，這也是果糧結(jié)合發(fā)酵的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)，桑葚保健酒中白藜蘆醇含量比一般保健食品中的含量要高，柴菊華等[19]研究不同葡萄品種釀制的葡萄酒中白藜蘆醇含量最高約為8.04 mg/L；閆仲麗等[20]測(cè)定果漿保健品中白藜蘆醇含量約為2.93 mg/L，同樣低于桑葚保健酒中白藜蘆醇含量。

保健酒中的白藜蘆醇主要來(lái)源于單獨(dú)發(fā)酵的桑葚果酒中，將發(fā)酵好的果酒和蒸餾酒混合之后，白藜蘆醇在自然條件下分別以自由態(tài)和糖苷兩種順?lè)串悩?gòu)體存在，自由態(tài)易溶于醇、酮類物質(zhì)，在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中隨著醇、酮類含量的增加有益于白藜蘆醇的浸提；另一方面異構(gòu)體白藜蘆醇糖苷在發(fā)酵過(guò)程中酶的誘導(dǎo)作用下釋放大量的白藜蘆醇，提高桑葚活性物質(zhì)的利用率，賦予蒸餾酒更高的保健價(jià)值。

2.2 保健酒中酯類和游離氨基酸分析

酯類是賦予酒體香味的芳香族物質(zhì)，酒中的酯含量及比例決定其香型和質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜HPLC(High Performance Liquid Chromatography)分析檢測(cè)了酒樣中的四大酯類含量（見表6）。

表6 結(jié)果顯示，桑葚保健酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯含量高于白酒1 號(hào)和白酒2 號(hào)，生成的乙酸乙酯含量也優(yōu)于霍權(quán)恭[21]報(bào)道的5 種不同香型白酒的含量，4 種酯比例獨(dú)特（乙酸乙酯＞乳酸乙酯＞己酸乙酯＞丁酸乙酯），符合清香型白酒風(fēng)格，從而形成了清爽甘洌、香味協(xié)調(diào)的獨(dú)特風(fēng)格[22]。四大酯類的含量變化對(duì)酒的風(fēng)格有著決定性的影響，乙酸乙酯含量高時(shí)呈蘋果和香蕉香，低時(shí)呈梨和菠蘿香；己酸乙酯濃時(shí)呈辛辣和臭味，其含量不能過(guò)高；乳酸乙酯賦予酒體醇厚帶甜的口感；丁酸乙酯濃時(shí)呈不愉快的脂肪臭味，稀時(shí)有朗姆酒的香味。總體而言，桑葚保健酒的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量高，丁酸乙酯和己酸乙酯含量低，酯香協(xié)調(diào)。

氨基酸主要來(lái)源于原料中蛋白質(zhì)的酶解,發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝產(chǎn)物和微生物細(xì)胞自溶[23-24]，酒中氨基酸對(duì)白酒的口味有一定影響[25]。分析酒中游離氨基酸可為揭示酒發(fā)酵、蒸餾和貯存過(guò)程中含氮化合物的變化提供依據(jù)。張莊英等[26]研究發(fā)現(xiàn)，成品酒游離氨基酸總量13.66～34.01 mg/L，桑葚保健酒中總游離氨基酸含量為31.2 mg/L，均高于白酒1 號(hào)和白酒2 號(hào)，加入桑葚之后氨基酸種類明顯增加，豐富白酒的口感和調(diào)節(jié)人體氨平衡。游離氨基酸含量的測(cè)定見表7。

表6 3種樣品中四大酯類物質(zhì)的含量對(duì)比

表7 酒樣中游離氨基酸含量的測(cè)定 (mg/L)

2.3 桑葚保健酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

白酒香氣豐富度取決于發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物，楊亮等[27]檢測(cè)到醬香型、濃香型白酒中揮發(fā)性物質(zhì)分別為60 種、35 種；鄧?yán)騕28]采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法共鑒定出33 種風(fēng)味化合物；牛云蔚等[29]在3 種五糧液酒中共鑒定出30種香氣物質(zhì)。

利用氣相-離子遷移譜定性分析桑葚保健酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，定性出47 種風(fēng)味物質(zhì)，其中23 種酯類物質(zhì)，8 種酮類物質(zhì)，7 種醇類物質(zhì)等，白酒1 號(hào)檢測(cè)出43 種，白酒2 號(hào)檢測(cè)出35 種；桑葚保健酒中的酯、酮和醇類都多于白酒1 號(hào)和白酒2號(hào)，其中醛類物質(zhì)種類較少，表明該酒比較柔和，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相比，風(fēng)味物質(zhì)種類豐富。表8 是桑葚保健酒風(fēng)味物質(zhì)種類對(duì)比。

2.4 氣相-離子遷移譜分析酒樣中物質(zhì)差異性

利用氣相-離子遷移譜對(duì)不同酒樣進(jìn)行分析，可以比較不同白酒和果酒之間的風(fēng)味差異性。圖4 是果酒和白酒之間的差異性對(duì)比。

從圖4 可以比較4 種酒之間的風(fēng)味物質(zhì)差異性，本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的桑葚蒸餾酒從圖4 可以看出，其揮發(fā)性物質(zhì)最為豐富，明顯優(yōu)于桑葚果酒，與某品牌高檔白酒1 號(hào)和中檔白酒2 相比風(fēng)味物質(zhì)也有一定的優(yōu)勢(shì)，推斷桑葚干果與多糧食結(jié)合發(fā)酵的工藝具有可行性，通過(guò)驗(yàn)證這種桑葚保健酒的風(fēng)味明顯優(yōu)于其他酒，既有糧食發(fā)酵白酒的風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)也有桑葚發(fā)酵酒賦予的果香和清香，還有美麗的色澤及保健因子。表明果糧結(jié)合的發(fā)酵酒和蒸餾酒到達(dá)了研發(fā)的預(yù)期目標(biāo)。

從圖5 可以看出不同酒樣的差異，首先，桑葚果酒樣品中揮發(fā)性有機(jī)成分明顯少于其他3 種酒樣中的揮發(fā)性成分；其次，桑葚保健酒樣品中的揮發(fā)性成分要比其他兩個(gè)（白酒1 號(hào)和白酒2 號(hào)）樣品中的揮發(fā)性有機(jī)成分多。其中1 號(hào)框中選出的揮發(fā)性有機(jī)物分別是桑葚保健酒、白酒1 號(hào)和白酒2 號(hào)酒樣中特有的，桑葚果酒中不存在；而4 號(hào)框選出的揮發(fā)性有機(jī)物則是桑葚果酒中特有的，白酒中則不存在；3 號(hào)框中的揮發(fā)性有機(jī)物則是桑葚保健酒和2 號(hào)白酒所含有的，而在2 號(hào)白酒中含量很少或者沒(méi)有；2 號(hào)框中的揮發(fā)性有機(jī)物則是桑葚保健酒和白酒2 號(hào)共有的；綜上比較得出桑葚保健酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最多，酒的香氣成分最為豐富。

表8 3種不同酒樣的揮發(fā)性物質(zhì)分析

3 結(jié)論

本文研究采用多糧與桑葚干果為原料，根據(jù)糧食固態(tài)發(fā)酵增香，桑葚果液態(tài)發(fā)酵酒除雜的原理，采取獨(dú)特的固液分離技術(shù)，利用中溫大曲和紅米曲混合發(fā)酵糖化劑，將所得兩種原酒精心勾兌，長(zhǎng)期貯存、自然老熟后包裝成產(chǎn)品。該產(chǎn)品入口綿甜，味道醇美，且果香明顯，色澤艷麗，具有獨(dú)特的風(fēng)格，應(yīng)屬創(chuàng)新型品種。

通過(guò)這種工藝釀制的桑葚保健酒中白藜蘆醇含量高于葡萄酒和一些桑葚保健品中的含量，酯類物質(zhì)也比其他香型白酒的種類多，風(fēng)味物質(zhì)豐富，工藝具有可行性，表明這種新型的果糧結(jié)合發(fā)酵酒和蒸餾酒結(jié)合的生產(chǎn)探索是具有社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益的。