紅曲霉的分離篩選及初步應(yīng)用研究

馬美榮，周林艷，李晶晶，劉小改，王小偉，張 坤

(北京紅星股份有限公司，北京101400）

紅曲霉(Monascus purpureus Went) 別名紅曲等，在我國(guó)的生產(chǎn)和使用已有1000 多年歷史，為真菌門子囊菌綱真子囊菌亞綱紅曲霉屬。紅曲霉具有耐酸和耐高溫的特性，且能耐10%vol 乙醇。紅曲霉的糖化型β－淀粉酶活性及蛋白酶活性較高，并有較強(qiáng)的酯化力[1]。除此之外，紅曲霉還有諸多有益功能：能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，對(duì)部分引起人和動(dòng)物疾病的細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用[2]；能夠分泌抑制膽固醇合成的活性物質(zhì)Monacolin K（莫那克林K），能有效降低人體的膽固醇[3]。我國(guó)許多名優(yōu)酒的釀造過(guò)程是多種天然微生物參與的生物化學(xué)過(guò)程，在許多名優(yōu)酒大曲中分離到紅曲霉[4-6]。篩選性狀優(yōu)良的紅曲霉菌株制作成紅曲，用于白酒釀造對(duì)改善白酒的品質(zhì)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種

紅曲霉、K 氏酵母、生香酵母：北京紅星股份有限公司分離保存。

黑曲霉麩曲：北京紅星股份有限公司釀造車間提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

紅曲霉分離、增殖培養(yǎng)基：10～12 °Bx 麥汁培養(yǎng)基。

紅曲霉固體培養(yǎng)基：米飯培養(yǎng)基。紅曲產(chǎn)酒精培養(yǎng)基：12°Bx玉米糖化液。

酵母液體種子培養(yǎng)基：10°Bx玉米糖化液。

1.1.3 儀器設(shè)備

氣相色譜儀(HP6890)，安捷倫公司；顯微鏡(BX51)，奧林巴斯公司；電子天平(LA230S)，賽多利斯公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲霉的分離

稱取約5 g 大曲粉或酒醅于250 mL 三角瓶中，加入約30 mL 無(wú)菌水，振搖30 min，制成菌懸液，取菌懸液接種于增殖培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min 培養(yǎng)24 h，增殖液經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布分離平板，30 ℃培養(yǎng)5～6 d。選擇早期菌落為白色，后期呈紅色、橙色或灰色的霉菌菌落轉(zhuǎn)接斜面。對(duì)分離的菌株進(jìn)行劃線分離、稀釋分離，純化后轉(zhuǎn)接斜面。

1.2.2 紅曲制作

小米以1‰乳酸水浸泡24 h，將水倒出并瀝凈多余的水。121 ℃滅菌30 min，冷卻后將米團(tuán)輕輕打散，接斜面菌種，于30 ℃下培養(yǎng)，每天搖動(dòng)三角瓶1～2 次，使米粒吸附瓶壁上的水珠，如此培養(yǎng)8～10 d。

1.2.3 紅曲酯化力測(cè)定

稱取5 g 紅曲樣品并吸取1 mL 乙酸或己酸，加入100 mL 的15 %vol 酒液中，置于30 ℃酯化5 d。蒸餾后蒸餾液用GC測(cè)定其中乙酸乙酯或己酸乙酯的含量。

色譜條件：DM-WX 毛細(xì)柱，柱溫程序升溫，檢測(cè)器溫度240 ℃，汽化室溫度230 ℃；載氣流速：氮?dú)?5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。

酯化酶活力=C/m

其中：C——酯化液中乙酸乙酯含量，mg/L；

M——紅曲用量，g。

1.2.4 紅曲糖化力測(cè)定

稱取5 g 紅曲樣品，加入90 mL 水和10 mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻。35 ℃水浴1 h，用脫脂棉過(guò)濾，棄去最初5 mL，接收其余澄清濾液進(jìn)行淀粉酶解糖測(cè)定，測(cè)定方法參照斐林定糖法。

其中：V0——加空白溶液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；

V——加紅曲糖化液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；

C——標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度，g/mL。

1.2.5 紅曲產(chǎn)酒精性能測(cè)定

稱取2 g 紅曲樣品加入200 mL 產(chǎn)酒精培養(yǎng)基中，30 ℃發(fā)酵7 d。發(fā)酵完畢，蒸餾，以酒精計(jì)測(cè)定蒸餾液的酒精度。

1.2.6 酵母培養(yǎng)

酵母斜面接種于液體試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好的液體試管轉(zhuǎn)接于液體三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)20～24 h（酒精酵母培養(yǎng)20 h，生香酵母培養(yǎng)24 h）。

1.2.7 紅曲霉在麩曲酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

按圖1所示流程進(jìn)行試驗(yàn)。

按照糖化發(fā)酵劑組成：(1)麩曲8 %、K 氏酵母4 %；(2)麩曲8 %、K 氏酵母4 %、產(chǎn)酯酵母0.5 %；(3)麩曲8 %、K 氏酵母4 %、產(chǎn)酯酵母0.5 %、紅曲0.1 %；(4)麩曲8 %、K 氏酵母4 %、紅曲0.1 %。按上述配比進(jìn)行清香型白酒麩曲發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵好的酒醅蒸酒，對(duì)酒樣進(jìn)行總酯和乙酸乙酯分析，并對(duì)酒樣進(jìn)行品嘗。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉的分離

紅曲霉的分離情況見(jiàn)表1。從所采用的酒醅和大曲中均能分離到紅曲霉，共分離到8株紅曲霉。

2.2 紅曲霉篩選研究

表1 紅曲霉分離情況

對(duì)公司保存的8 株紅曲霉分別制備紅曲，進(jìn)行紅曲酯化力研究、糖化力研究、產(chǎn)酒精性能研究，從中篩選進(jìn)一步應(yīng)用的紅曲霉。

2.2.1 紅曲酯化力研究

8 份紅曲樣品的酯化力見(jiàn)表2，從結(jié)果來(lái)看，紅曲霉對(duì)己酸的酯化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)乙酸的酯化能力，這些紅曲中，對(duì)己酸酯化能力最強(qiáng)的紅曲為E，達(dá)到1949.3 mg/g·L，其次為D 的1507.3 mg/g·L；對(duì)乙酸酯化能力最強(qiáng)的紅曲為D，達(dá)到597.9 mg/g·L，其次為E 的578.5 mg/g·L。紅曲A、紅曲B 的酯化結(jié)果低于對(duì)照，可能這些紅曲的酯分解能力更強(qiáng)，劉賓[7]在研究紅曲酯化能力時(shí)也出現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象。

表2 紅曲酯化力測(cè)定結(jié)果

2.2.2 紅曲糖化力研究

8 份紅曲樣品的糖化能力結(jié)果見(jiàn)表3，不同的紅曲，糖化能力相差很大，紅曲D 的糖化力最高，可達(dá)1594.22 U/g，紅曲E 次之，為1224.99 U/g，紅曲B、C、H的糖化力為0。

2.2.3 紅曲產(chǎn)酒精能力研究（表4）

表3 紅曲糖化力測(cè)定結(jié)果

表4 紅曲產(chǎn)酒精能力測(cè)定結(jié)果

由表4 可知，不同的紅曲，其產(chǎn)酒精能力差別很大，其中紅曲G 的能力最高，達(dá)5.1 %vol，紅曲E次之，為4.6%vol，紅曲B最低，為1.0%vol。

本次研究采用的8 株紅曲霉，不同菌株之間的菌落外觀及生長(zhǎng)特性各不相同，糖化力、酯化力、產(chǎn)酒精能力差異也較大，綜合來(lái)看，紅曲E 有較強(qiáng)的酯化力、糖化力、產(chǎn)酒精能力，因此以紅曲霉E 進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

2.3 紅曲霉在麩曲酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

紅曲霉具有增酯能力，生香酵母也具有增酯能力，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與對(duì)照相比，白酒發(fā)酵體系中加入紅曲，酒中的總酯、乙酸乙酯含量均升高（見(jiàn)表5），總酯增加了44.86%，乙酸乙酯增加了87.30%，紅曲霉E 確有增酯效果。但紅曲霉增酯能力不及生香酵母增酯含量量高，且應(yīng)用該紅曲霉與生香酵母協(xié)同增酯效果并不比單純使用生香酵母進(jìn)行增酯效果突出。劉桂君等[8]研究表明，6 種紅曲、釀酒酵母、生香酵母混合菌種組合在大曲酒生產(chǎn)中，有3個(gè)組合強(qiáng)化發(fā)酵的基酒中乙酸乙酯含量比普通基酒有較大提高。這說(shuō)明紅曲產(chǎn)酯能力的作用除與紅曲霉菌種本身有關(guān)外，其與其他微生物的協(xié)同作用也有很大關(guān)系。結(jié)合作者的研究結(jié)果與劉桂君等[8]的研究結(jié)果來(lái)看，紅曲霉與釀酒酵母、生香酵母對(duì)產(chǎn)酯的協(xié)同作用，與不同紅曲霉的特性有關(guān)。

表5 生產(chǎn)應(yīng)用酒樣總酯、乙酸乙酯理化指標(biāo)

從酒樣品嘗結(jié)果來(lái)看，在清香型麩曲白酒發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用紅曲霉，可改善原酒的口感，提升原酒品質(zhì)。紅曲、生香酵母混合應(yīng)用，雖然對(duì)增酯無(wú)協(xié)同作用，但對(duì)口感改善效果更明顯。感官品嘗結(jié)果見(jiàn)表6。

3 小結(jié)

本次研究采用的8 株紅曲霉，不同菌株之間的菌落外觀及生長(zhǎng)特性各不相同，糖化力、酯化力、產(chǎn)酒精能力差異也較大。紅曲霉在釀酒中應(yīng)用具有增酯作用，但效果不如生香酵母，所應(yīng)用菌種與所使用的生香酵母在白酒增酯方面也無(wú)相互促進(jìn)作用，可進(jìn)一步優(yōu)選菌種，進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用研究。

紅曲霉具有產(chǎn)生生理活性物質(zhì)的能力，“健康中國(guó)2030”國(guó)家戰(zhàn)略和消費(fèi)者消費(fèi)理念的轉(zhuǎn)變，如何把紅曲霉的保健功能與中國(guó)白酒相結(jié)合，造福消費(fèi)者，是白酒科技工作者的重要研究課題。