耐高溫釀酒酵母菌的篩選及發酵性能研究

劉 輝 ，何太波，趙國淼，張永昌，王小艷，李 凡，佟 毅

（1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江肇東 151100；2.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；3.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033）

生物燃料乙醇是指未添加變性劑，以生物質為原料生產的可作為燃料用的乙醇，純度99.5 %，屬于環保型可再生清潔能源。近年來，隨著全球環境的惡化及化石能源的日益枯竭，越來越多的國家開始關注可再生清潔能源燃料乙醇的開發和利用[1-4]]。燃料乙醇通常采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發酵，釀酒酵母最適生長溫度為30～32 ℃[5]。然而，在工業生產中隨著菌株生產過程中的代謝、機械攪拌等常導致發酵體系溫度升高（時?？蛇_35～37 ℃）[6-8]。高溫通常會引起酵母細胞內各種成分的理化性質發生變化，影響細胞本身正常的生命活動。高溫脅迫使得菌株的生產性能大幅下降，溫度越高越容易引起酵母早衰、死亡。然而目前工業生產中一般采用一次水及冷凍水循環對發酵罐進行控溫，受季節環境溫度變化的影響，很難實現穩定控溫，不僅導致生產成本增加，還增加了染菌的風險。而耐高溫釀酒酵母的開發及應用可實現在較為寬泛的控溫前提下保證燃料乙醇生產的穩定性，避免這部分經濟損失[9]。

在長期的進化過程中，微生物細胞的生化反應和代謝途徑發生改變，形成了對發酵微環境的適應性[10]。對生長環境條件變化的適應能力，以及能夠隨著外界環境的變化迅速產生變異，為耐高溫酵母的選育提供了基礎。田沈等[11]對1株耐高溫麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa）進行高溫馴化，馴化后的菌株在46 ℃條件下同步糖化發酵，乙醇質量濃度達到13.93 g/L，使乙醇轉化率達到理論值的88.2 %。徐大鵬等[12]篩選得到1 株在41 ℃可以良好生長的耐高溫酵母菌，在41 ℃下發酵24 h，得到44.0 g/L 的乙醇，理論產率的93.0%。Kwon 等[13]在42 ℃條件下發酵甜高粱稈，乙醇得率為90.9 %。劉秀穎等[14]通過誘變和重組方法獲得的釀酒酵母突變株在40 ℃和43 ℃發酵時，乙醇產量分別達到91.2 g/L 和69.2 g/L。Dhaliwal 等[15]篩選到1 株耐高溫的東方伊薩酵母（Issatchenkio orientalis，Io），在40 ℃條件下以甘蔗汁作為培養基進行發酵，乙醇質量濃度達到71.9 g/L。本實驗擬通過ARTP 誘變和溫度馴化，篩選出在高溫條件下具有較強發酵性能的釀酒酵母菌株，并對菌株的耐溫性和產乙醇能力進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：釀酒酵母為市售釀酒酵母，該酵母最適生長溫度為32 ℃。

主要試劑：酵母粉，Oxoid 公司；蛋白胨，Oxoid公司；氯化鈉，北京化工廠；瓊脂，Amresco 公司；瓊脂糖，西班牙（上海分裝）；冰醋酸，北京化工廠；山梨醇，Amresco公司；Tris，Sigma公司。

YPD固體培養基：用于釀酒酵母和畢赤酵母的活化、培養及菌種保存，含有1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，15 %瓊脂，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 ARTP誘變與篩選

1.2.1 釀酒酵母生長曲線的測定

將活化好的菌液以5 %的接種量接種到YPD液體培養基中，在28 ℃下培養，每間隔2 h 取1 次樣，測量OD600nm吸光值，根據吸光值繪制生長曲線，確定酵母的生長對數期。

1.2.2 ARTP誘變實驗

將釀酒酵母發酵液稀釋107倍，取100 μL 涂布YPD 固體平板，待長出單菌落后，挑取單菌落接種至YPD 液體培養基中，30 ℃、250 r/min 進行搖瓶培養，培養至OD600值為1.0～1.5，10%轉接并培養5 h左右，以0.1 %的轉接量用無菌生理鹽水稀釋并制備懸液。

設置多功能等離子體誘變系統，以氮氣作為等離子體的工作氣體，設置電源功率300 W，平臺高度14 mm，等離子體的溫度＜35 ℃，濕度＞10 %，氣體流量12 slpm，分別將制備的50 μL菌懸液滴于無菌金屬槽內中心位置進行等離子體照射，處理時間分別為20 s、70 s、120 s、170 s、220 s、270 s、320 s、370 s、420 s。誘變處理完成后以無菌生理鹽水對處理完的菌懸液進行梯度稀釋，涂布于YPD 固體平板，將平板分別放置于不同溫度的生化培養箱中培養。將誘變后生長及發酵性能較好的菌株接種液化醪，37 ℃搖瓶發酵。

1.3 發酵驗證

取生產系統液化醪，對ARTP 誘變篩選出的釀酒酵母進一步調整溫度進行工業物料小試驗證。工藝條件：生產系統液化醪為底物，對照菌株（目前液體燃料乙醇工業生產菌株）干粉35 ℃活化后添加，ARTP 誘變篩選出的S.C HR 接種于種子培養基（YPD液體培養基）中，經過二級培養達到一定的酵母數，按0.125 億/mL液化醪計算用量，離心、水洗1次，用生理鹽水懸浮至2 mL，在1 L 搖瓶中加入350 g 液化醪中。發酵過程測試菌株試驗組均進行溫度調整（0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃），并加入對照菌株的空白試驗組（不調整溫度，一直控溫32 ℃）進行對照。

2 結果與討論

2.1 酵母菌生長曲線的測定

對菌株進行ARTP 誘變時，一般選取對數中后期的菌株，此時菌株代謝活性高、繁殖旺盛，易發生突變且重復性好[16]。出發菌株在種子液培養基中的生長曲線如圖1 所示，將酵母菌接入種子液培養基中，前4 h 酵母菌處于遲緩期，微生物的代謝系統需要適應新環境，因此數目增長緩慢[17]。在4～12 h 酵母菌數量增長迅速，處于對數生長期，在14 h 后酵母菌進入穩定期，因此本試驗選擇在10 h 時對酵母菌進行誘變試驗。

2.2 ARTP誘變結果

誘變處理劑量和時間影響致死率和突變效率，一般認為出發菌株穩定時，即當致死率在80 %左右時，有較高的正突變率[15-16]，因此試驗選擇處理時間為240 s，致死率為80 %的誘變菌株。對出發菌株進行ARTP 誘變處理，并繪制致死率曲線（圖2）。第一輪誘變當照射時間為240 s 時，致死率為80%左右，篩選到正向突變菌株的可能性最大，選擇240 s 為誘變時間。誘變處理完成后以無菌生理鹽水對處理完的菌懸液進行梯度稀釋，涂布于YPD固體平板，將平板分別放置于40 ℃的生化培養箱中培養24 h，篩選出誘變后生長及發酵性能較好的7個突變菌株。

2.3 搖瓶驗證

對篩選出的7 個菌株進行液化醪搖瓶發酵驗證。使用生產系統液化醪，37 ℃搖瓶發酵72 h 驗證結果。7個菌株37 ℃搖瓶發酵結果見表1。結果顯示，其中HR-B19（命名為S.C HR）乙醇產量均顯著高于對照菌株，葡萄糖殘留、殘還原糖、殘總糖、乙醇/甘油均優于對照菌株。

表1 37 ℃發酵成熟醪HPLC檢測結果 (g/L)

2.4 工業物料小試驗證

取生產系統液化醪為發酵底物，對ARTP 誘變篩選出的耐高溫釀酒酵母S.C HR 進行發酵小試驗證。以市售釀酒酵母菌株，發酵過程不調整溫度為對照組，分為控溫（32 ℃）和溫度調整（溫度調整規律：0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃）；S.C HR（溫度調整）為ARTP 誘變篩選菌株，溫度調整規律：0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h。發酵成熟醪酒精度如圖3 所示，在不控溫的高溫情況下（35～37 ℃），工業物料小試驗證其同步糖化發酵完成后，S.C HR 乙醇產量為15.03%vol，較出發菌株提升了0.21%vol，殘總糖2.38 g/100 mL，較出發菌株降低了0.05 g/100 mL。發酵產物HPLC 檢測結果見表2，菌株S.C HR 在高溫下的發酵各項指標均達到對照菌株正?？販貤l件下的發酵性能。

3 結論

表2 S.C HR菌株與對照菌株發酵HPLC數據(g/100 mL)

與傳統的誘變方法相比，ARTP 誘變對生物的遺傳物質的損傷機制豐富，突變率高，并易獲得遺傳穩定性良好的突變株，是非常有效的真核生物誘變方法[18]。在本研究中，以市售釀酒酵母為出發菌株，通過ARTP 誘變、高溫篩選和搖瓶驗證，最終篩選到1 株釀酒酵母S.C HR。工業物料小試驗證結果發現，高溫發酵條件下（35～37 ℃），S.C HR 乙醇產量為15.03%vol，較出發菌株提升0.21%vol，殘總糖2.38 g/100 mL，較出發菌株降低0.05 g/100 mL。殘總糖是酒精發酵后未被發酵而殘余的糖分，殘糖高低是衡量酒精發酵完全程度的重要指標之一[19]。殘糖偏高意味著糖分不能有效地轉化為酒精，產酒率偏低，造成原料的損失，控制殘糖水平是酒精企業提高出酒率和經濟效益的關鍵。菌株S.C.HR 在高溫下的發酵各項指標（殘總糖、殘還原糖、酒精度）均達到與對照菌株正常控溫條件下的發酵性能，葡萄糖殘留、殘總糖、乙醇/甘油均優于對照菌株。該菌株可在高溫條件下（35～37 ℃）保證乙醇生產的穩定性，提高乙醇生產效率，降低生產成本，適合于工業乙醇的大規模生產。