飲用酒和食用酒精暴露誘導小鼠肝臟組織的損傷效應

魏夢嬌，姚高毅，郭 琳

（1.山西大學環境與資源學院環境與健康研究中心，山西太原 030006；2.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032205）

隨著我國嗜酒人數的逐年增加，酒精性肝病也呈現出明顯的上升趨勢，成為僅次于甲肝乙肝等病毒性肝病的第二大肝臟疾病[1]。據估計，每年因濫用酒精死亡的人數大約有250 萬人，其中大部分人死于酒精性肝病（ALD）[2]。作為酒精的主要代謝器官，肝臟的毒性作用相較于其他臟器更為明顯。脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌，都是典型的酒精性肝病[3]。有文獻表明，幾乎所有長期暴露于酒精的個體都會發展為脂肪肝，約有25 %會發展成為肝硬化[4-5]。

已有的實驗研究表明，食用酒精會引起嚙齒類動物肝臟損傷[6-8]。如劉暢等[9]實驗證明,食用酒精可以誘導小鼠肝臟質量和肝臟指數上升以及炎性細胞浸潤等肝臟損傷；董金材等[10]證明，食用酒精也會引起小鼠肝細胞氧化應激和脂質過氧化；管文婕等[11]證明，食用酒精可誘導肝臟脂肪變性及肝纖維化。然而關于比較飲用酒和食用酒精誘導小鼠肝臟組織損傷的分子機制研究卻鮮有報道。本實驗借助小鼠灌胃模型，在氧化應激、自噬效應和細胞凋亡等方面來比較飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝臟組織的毒性效應，探究可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗樣：市售42%vol 飲用酒。42.0%vol 食用酒精。

實驗動物：SPF 級雄性的C57BL/6J 小鼠30 只，體重（20±2）g，從北京維通利華實驗動物技術有限公司購入。

試劑及耗材：SDS-PAGE 電泳及相關蛋白裂解液試劑均購自Amresco 公司；牛血清蛋白（BSA）購自Invitrogen 公司；考馬斯亮藍（G-250）購自Sigma 公司；一抗β-actin 購自Cell Signaling Technology 公司，二抗Bcl-2，Bax，P53，Beclin-1，LC3B 均購自北京博奧森公司；ROS 檢測試劑盒（Item Number S0033）購自碧云天公司；MDA、SOD 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

儀器設備：高速低溫離心機、低溫冰箱及多功能酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；凝膠成像系統和垂直電泳槽，美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

30 只雄性的C57BL/6J 小鼠隨機分為3 組：對照組、飲用酒處理組和食用酒精處理組，每組10只。將小鼠飼養在溫度為（24±2）℃、相對濕度50%～55%的房間中，光照、黑暗周期為12 h，動物適應性喂養1 周，隨意飲用自來水。通過灌胃[12]分別一次性灌服0.5 mL 的蒸餾水，飲用酒樣以及42.0%vol 的食用酒精。每周一次，連續灌服5 周后處死小鼠，迅速解剖取小鼠的肝臟組織，放于液氮中快速冰凍，隨后轉至-80 ℃下儲存備用。

1.2.2 Western Blot分析

取30 mg 肝臟組織樣品，加入500 μL 裂解液，在勻漿機上進行充分勻漿。勻漿完成后冰上孵育20 min。然后在13000 r/min，4 ℃的條件下對樣品離心15 min，離心完成后取上清液，用考馬斯亮藍法測定其蛋白濃度。將其進行等量分裝，于-20 ℃保存備用。取60 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用質量分數為3%的牛血清蛋白（BSA）封閉1 h后，加入一定比例一抗（β-actin：1∶1000，Bax、Bcl-2、P53、LC3B、Beclin-1：1∶500），在4 ℃條件下搖床孵育過夜。用PBS 洗膜3 次，每次10 min，結束后用熒光標記的第二抗體（1∶5000）孵育2 h，孵育完成后，清洗二抗。用LI-COR Odyssey 近紅外雙色激光成像系統掃膜分析，并用IPwin32 軟件處理分析目標條帶的光密度值。最終結果用目的蛋白與βactin的光密度比值來表示。

1.2.3 活性氧及其相關酶的測定

取小鼠肝臟組織樣品25 mg，加入500 μL 0.1 M PBS 緩沖液，充分勻漿。在4 ℃，1000 G 的條件下離心10 min，取上清液。照試劑盒說明測定不同組小鼠肝臟組織ROS活性及MDA、SOD的含量。

1.3 數據分析方法

數據以均值±標準誤（mean 值法組）的形式表示。采用origin2017對數據進行統計分析作圖。用單因素方差分析法（One-way ANOVA法）檢驗飲用酒組、食用酒精組與對照組及飲用酒組與食用酒精組差異顯著性（與對照組相比：* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001；與飲用酒組相比：#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001）。

2 結果與分析

2.1 飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝組織氧化應激反應的影響（圖1）

由圖1 可以看出，飲用酒和食用酒精暴露后，小鼠肝臟組織中的ROS 活性顯著增加，分別為對照組的3.76 倍、5.15 倍（p＜0.001，p＜0.001）；與此同時，小鼠肝臟組織中促氧化因子和抗氧化因子的表達發生相應的變化，其中過氧化氫酶MDA 的水平上升，分別為對照組的2.21 倍、2.73 倍（p＜0.01，p＜0.01），超氧化物歧化酶SOD 水平明顯降低，分別為對照組的0.82 倍、0.42 倍（p＜0.05，p＜0.01）。除此之外，與飲用酒處理組相比，食用酒精處理組肝臟氧化應激效應更為明顯，呈現出統計學差異（p＜0.05）。

2.2 飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝組織自噬相關蛋白表達的影響（圖2）

由圖2 可以看出，與對照組相比，飲用酒組和食用酒精組的自噬相關因子的表達呈上升趨勢。其中自噬標志因子LC3B 的表達分別增加為對照組的1.42 倍、1.79 倍，Beclin-1 的表達增加分別為對照組的1.43 倍、1.78 倍，說明乙醇能夠誘導小鼠肝臟體內細胞自噬水平上升；食用酒精組的LC3B和Beclin-1 表達增加更為明顯，具有統計學意義（p＜0.05），表明其誘導的肝細胞自噬程度較飲用酒組大。

2.3 飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝組織凋亡相關蛋白表達的影響（圖3）

由圖3A、圖3B、圖3C 可知，飲用酒和食用酒精灌胃處理小鼠后，Bax 的表達分別上調為對照組的1.28 倍、1.31 倍，Bcl-2 的表達分別下降為對照組的0.58 倍、0.43 倍（p＜0.05，p＜0.01），Bax/Bcl-2 的比值具有顯著性差異，分別為對照組的2.24 倍、3.03倍（p＜0.05，p＜0.01）；由圖3D 可以看出，飲用酒組和食用酒精組的P53 表達分別升高為對照組的1.51 倍、1.88 倍（p＜0.05，p＜0.01）；食用酒精組與飲用酒組相比，Bax/Bcl-2 的比值以及P53 的表達增加更為明顯，具有顯著性差異（p＜0.05）。

3 討論與結論

乙醇誘導機體損傷的機制復雜多樣，主要有代謝產物乙醛的毒性效應、氧化應激、炎癥反應、線粒體功能障礙、細胞凋亡、自噬及內毒素等。有相關研究表明，氧化應激在酒精性肝損傷的發展中起著重要作用[13-14]。乙醇進入小鼠體內，誘導肝臟中代謝乙醇的主要酶——CYP2E1 的活性增加，從而導致大量的ROS 產生[15]，細胞呈現氧化應激狀態。活性氧（ROS）的產生和積累，不斷耗竭SOD 等抗氧化因子，對抗氧化系統產生抑制效果，促使氧化因子（如MDA）的大量積累，導致促氧化物與抗氧化物之間的動態平衡失調，產生了大量受損的線粒體致使肝細胞凋亡或死亡[16-17]，導致肝功能受損。

自噬發生過程中有由兩個類泛素共軛系統介導，分別是Atg5-Atg12-Atg16連接系統和Atg8/LC3連接系統，作用于自噬囊泡膜的進一步延長。自噬發生時，Atg16和Atg12-Atg5結合，使LC3轉化為脂共軛膜結合型LC3B，直到自噬溶酶體形成[18-19]。迄今為止，在完整的自噬小體上只發現了LC3，故而被廣泛地作為研究自噬的標志分子，因此LC3B 水平升高通常表明自噬小體的聚集[20-21]。Beclin-1 是酵母自噬基因6 在哺乳動物的同源物，它可與抗凋亡因子Bcl-2 相互作用，參與自噬和調亡的啟動過程，對細胞生存和死亡具有重要意義[22-23]。自噬被認為是眾多細胞的生存調節因素，適度的自噬作為保護可以清除多余的代謝蛋白，但自噬不足或過強時，則會導致組織細胞死亡。本研究表明，乙醇暴露促使肝細胞體內的LC3B 及Beclin-1 的表達增加，說明在乙醇的誘導下，大量受損的線粒體和ROS自由基產生，自噬反應被激活，產生大量自噬小體和溶酶體，消化降解體內細胞，引起肝細胞死亡。

Bcl-2 家族相關基因的表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一[24]，Bcl-2 和Bax 分別作為Bcl-2 家族中抗凋亡和促凋亡的代表基因，在肝細胞凋亡的基因調控中起著中心作用[25]。P53 基因作為細胞周期G1 期DNA 損傷的檢查點，在正常情況下具有阻斷細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用[26]。研究結果表明，飲用酒和食用酒精處理小鼠后，抑癌基因P53 的表達增加，同時上調促凋亡基因Bax的轉錄，抑制抗凋亡基因Bcl-2 的表達，Bax/Bcl-2的比值具有顯著性差異。乙醇暴露情況誘導下細胞凋亡增多，雖然其在一定程度上利于調節肝功能，但當細胞凋亡增加所致肝臟損傷超過其代償能力時，會導致肝臟結構和功能的異常，甚至導致各種肝臟疾病。

研究結果表明，由于親肝性毒物乙醇的暴露，誘導小鼠肝臟組織氧化應激的發生，促進細胞發生自噬，進而誘導細胞凋亡，導致飲用酒組和食用酒精組都表現出明顯的肝損傷；值得注意的是，在相同酒精度數情況下，食用酒精暴露誘導的肝臟損傷程度更大，且具有明顯的統計學差異，提示飲用酒在釀制過程中產生的某些組分可能對酒精性肝損傷起到一定的保護作用，其機理還需要進一步研究確定[27-29]。