聚能式脈沖超聲-HPLC-ELSD測定概念雞蛋中磷脂酰膽堿

陳興*，張娟，張軍慧

中檢集團中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測（河南）有限公司（鄭州 450000）

卵磷脂被譽為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營養(yǎng)素”，狹義上的卵磷脂是指磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）[1-2]。PC是細胞膜的重要組成部分，它具有疏通血管、保護肝臟、調(diào)節(jié)血糖和健腦益智等作用[3-6]。PC還是一種天然食用乳化劑，現(xiàn)已被廣泛用于食品、醫(yī)藥和化工等領域[7-8]。PC的提取原料主要來自禽蛋蛋黃和大豆，其中禽蛋蛋黃中PC含量較高[9]。雞蛋作為最主要的禽蛋品種，不僅富含蛋白質(zhì)，還提供人體必需的PC等各種營養(yǎng)素[10-11]。近幾年，隨著人們對食品安全和健康的要求越來越高，被冠以五谷蛋、土雞蛋、山雞蛋等概念雞蛋也越來越多[12]。概念雞蛋的問世不僅為消費者提供了更多選擇空間，與此同時，概念雞蛋是否比普通雞蛋更營養(yǎng)也成了困擾消費者的難題。

目前，文獻報道的雞蛋中PC的提取方法主要有超聲波提取法和超臨界CO2萃取法[11,13-15]，而采用聚能式脈沖超聲提取雞蛋中PC未見報道。全蛋液包括蛋清和蛋黃，雖然PC主要存在于蛋黃中，但是在日常檢測的216批次雞蛋中，80%以上客戶要求檢測全蛋液中PC的含量。蛋清中蛋白質(zhì)含量較高，遇到有機溶劑會變性沉淀，不利于PC的提取。聚能式脈沖超聲波提取法不僅能夠有效破碎上述沉淀物和細胞，釋放PC，而且還可有效防止提取劑發(fā)熱，減少損失。試驗以PC含量為指標，通過單因素試驗和響應面優(yōu)化法，優(yōu)化了聚能式脈沖超聲提取條件，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定概念雞蛋中PC的含量。該方法操作簡便、快速準確、提取劑用量少、重現(xiàn)性良好，可滿足試驗要求。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（配有Alltech ELSD 2000型蒸發(fā)光散射檢測器）：日本島津公司；BILON-250Y超聲波細胞破碎機（總功率250 W）：上海比朗儀器制造有限公司；TDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機（廣州市墨菲儀器有限公司）；BT125D電子天平（Sartorius）；DDQ-B01A1打蛋器（小熊電器股份有限公司）。

1.2 試劑與材料

正己烷（色譜純）：Honeywell；異丙醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；正己烷、異丙醇、醋酸（分析純）：廣州化學試劑廠；去離子水（自制）；磷脂酰膽堿（99%，來源蛋黃）：Sigma。

PC提取劑：量取800 mL正己烷、800 mL異丙醇和100 mL 0.1%醋酸，超聲混勻備用[16]。

2 方法

2.1 對照品制備

對照品儲備液：精密稱取18.2 mg PC于10 mL棕色容量瓶中，用PC提取劑溶解并定容至刻度，濃度為1.80 mg/mL。對照品工作液：用PC提取劑將上述儲備液逐級稀釋成濃度分別為360，240，120，60和30 mg/L的系列工作液。

2.2 樣品制備

預處理：取5顆生雞蛋，將蛋清和蛋黃并入燒杯后，打散混勻備用。

樣品提取：稱取1.0 g于50 mL離心管中，準確加入15.0 mL提取劑，置于冰水浴中，超聲功率比為40%，全程時間為4.0 min，超聲/間隙時間為2/3（s/s），超聲提取后過濾上機。

2.3 色譜條件

色譜柱：菲羅門硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：正己烷-異丙醇-水-乙酸-三乙胺體積比2∶74∶24∶1.5∶0.08。流速：1.0 mL/min。柱溫：40 ℃。進樣量：20 μL。蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度：100 ℃。載氣（氮氣）流速：2.0 L/min。

2.4 工藝優(yōu)化試驗

2.4.1 單因素試驗

稱取1.0 g混合液，超聲總功率為250 W，以PC含量為指標，探討超聲功率比（10%，20%，30%，40%和50%）、全程時間（1，3，5，7和9 min）、單個超聲/間隙時間（1/1，2/2，2/3，3/3和3/4 s/s）和液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1 mL/g）對PC含量的影響。

2.4.2 因素水平設計

由單因素試驗結果得出影響聚能式脈沖超聲提取法的3個主要因素：超聲功率比、全程時間和液料比。以單因素優(yōu)化試驗結果為基礎，采用響應面優(yōu)化法進行參數(shù)優(yōu)化，以超聲功率比（A）、全程時間（B）和液料比（C）為自變量，PC含量為響應值進行設計，因素水平設計表見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 超聲功率比的影響

全程時間為3 min，超聲/間隙時間為2/2（s/s），液料比為15∶1（mL/g），超聲功率比分別選擇10%，20%，30%，40%和50%進行提取，結果見圖1。當超聲功率比為30%時，PC含量最大。超聲功率比過小，聲波的空化效應欠佳，不能有效破碎細胞提取PC；超聲功率比過大，產(chǎn)生的空化效應會阻礙超聲波的傳播，而且容易引起液體飛濺，不利于試驗進行。因此選定30%為最佳超聲功率比[17]。

圖1 超聲功率比對磷脂酰膽堿含量的影響

3.1.2 全程時間的影響

超聲/間隙時間為2/2（s/s），液料比為15∶1（mL/g），超聲功率比為30%，全程時間分別選擇1，3，5，7和9 min進行提取，結果見圖2。當全程時間為3 min時，PC含量最大。3 min過后PC含量呈降低趨勢。可能是隨著超聲時間的增加，探頭升溫，容易引起正己烷揮發(fā)，進而改變提取劑的極性，影響PC含量。因此最佳全程時間選擇3 min。

圖2 全程時間對磷脂酰膽堿含量的影響

3.1.3 超聲/間隙時間的影響

液料比為15∶1（mL/g），超聲功率比為30%，全程時間為3 min，超聲/間隙時間分別選擇1/1，2/2，2/3，3/3和3/4（s/s）進行提取，結果見圖3。當超聲/間隙時間為2/3（s/s）時，PC含量效果最好，但整體而言，由于PC增長率＜2.5%，超聲/間隙時間的選擇對PC含量的影響較小，可能是只要單組超聲時間≥1 s，聚能式超聲波的空化效應即可有效破碎沉淀物和細胞，實現(xiàn)PC的快速提取。

圖3 超聲/間隙時間對磷脂酰膽堿含量的影響

3.1.4 液料比的影響

超聲功率比為30%，全程時間為3 min，超聲/間隙時間為2/2（s/s），液料比分別選擇10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1（mL/g）進行提取，結果見圖4。隨著液料比的不斷增加，PC含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，當液料比為15∶1（mL/g）時PC含量達到最大值。當液料比大于15∶1（mL/g）時，提取劑體積增大，單位體積所受到的聲波空化效應降低，使得提取率下降；當液料比小于15∶1（mL/g）時，提取劑過少，提取濃度相對較高，PC傳質(zhì)動力不足。因此選定超聲提取最佳液料比15∶1（mL/g）[18]。

3.2 響應面法優(yōu)化提取條件

3.2.1 響應面試驗結果與分析

由表1中的響應面試驗方案，得到響應面試驗設計與結果，見表2。使用Design Expert 7.0軟件對表2的試驗結果進行分析，得到回歸方程方差分析，見表3。由表3可知，整體模型p＜0.001，失擬項p=0.264 3，說明該模型擬合成功[19]。對表2的試驗結果進行二次多項式模型擬合，得到回歸方程：Y含量=1.91+0.056A+0.070B-0.016C+0.000AB+7.5×10-3AC+5.0×10-3BC-0.073A2-0.096B2-0.063C2（R2=0.979 3）。

圖4 液料比對磷脂酰膽堿含量的影響

表2 響應面試驗設計與結果

3.2.2 響應曲面分析

對表2中的試驗結果進行響應曲面分析，得出兩兩因素之間對PC含量的影響，結果如圖5所示。通過對比表3中各因素p值和對圖5進行響應曲面分析，得出3個因素之間對PC含量的影響順序：全程時間＞超聲功率比＞料液比[20]。Design-Expert 7.0軟件給出的最佳提取條件為：超聲功率比40%，全程時間3.72 min，液料比14.75∶1（mL/g）。在此條件下，PC的理論含量為1.91×104mg/kg。為方便實際操作，修正后的最佳提取條件為：超聲功率比40%，全程時間4.0 min，液料比15∶1（mL/g）。做3次平行試驗，PC含量為1.93×104mg/kg，與預測值誤差僅為1.05%，說明采用該方法獲得的提取條件準確可靠。

圖5 PC含量因素間的交互作用圖

3.3 方法的線性范圍、精密度和檢出限

將PC的系列標準工作液進行上機測定，以PC峰面積的常用對數(shù)為縱坐標（Y），進樣質(zhì)量的常用對數(shù)（X）為橫坐標作圖，求得線性回歸方程：Y=1.448X+13.62，線性回歸方程相關系數(shù)r=0.999 9，可知PC在30～360 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關系。

準確稱取6份“散養(yǎng)雞蛋”樣品，前處理參照“2.2”，通過上機測定，求得相對標準偏差，為2.53%。當取樣量為1.0 g、定容體積為15 mL時，檢出限為50 mg/kg（信噪比S/N=3）。

3.4 方法的加標回收率和相對標準偏差

選定“散養(yǎng)雞蛋”進行加標試驗，分別添加高、中和低濃度的對照品，每個加標水平均做平行樣，測得PC平均加標回收率，為95.8%～103.0%，相對標準偏差為2.70%，具體結果見表4。

表4 加標回收率結果（n=2）

3.5 實際樣品測定

PC是雞蛋中常見的一種營養(yǎng)素，通過對36種概念雞蛋中PC含量進行測定，結果表明：（1）不同概念雞蛋中PC含量差別較大；（2）某些概念雞蛋中PC的含量低于普通雞蛋。部分數(shù)據(jù)結果見表5，對照品和部分樣品圖譜見圖6，PC保留時間為9.2 min。

圖6 對照品和樣品的色譜圖

表5 概念雞蛋中磷脂酰膽堿的含量

4 結論

在單因素試驗基礎上，確定了顯著影響因素及水平；通過Box-Behnken響應面優(yōu)化法，確定了概念雞蛋中磷脂酰膽堿的最佳提取條件。該方法針對性強、操作簡便、快速準確、提取劑用量少、重現(xiàn)性良好，既可為禽蛋中其他磷脂的方法開發(fā)提供參考，也可為類似基質(zhì)樣品中PC的測定提供技術借鑒。通過對市售的36種概念雞蛋進行測定，明確了各種雞蛋中磷脂酰膽堿的含量情況，可為消費者選擇提供數(shù)據(jù)參考。