pH示差法測定紅花羊蹄甲花瓣花色苷的含量

張鵬 ，駱琴，唐森 ，謝濟運 *

1. 廣西科技師范學院食品與生化工程學院（來賓 546119）；

2. 廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室（來賓 546119）

花色苷（Anthocyanin）是具有2-苯基苯并吡喃陽離子基本母核結構的一系列衍生物的總稱，其作為存在植物體細胞液泡中的次生代謝產物，是花朵和果實的呈色物質[1]。花色苷是水溶性色素，具有廣泛的生物活性，其清除自由基能力顯著，具有較強的抗氧化性，可用于食品、藥品、保健品、化妝品等領域[2]。

紅花羊蹄甲（Bauhinia blakeana Dunn）是廣泛種植于我國華南地區的園林綠化觀賞植物，花期全年，花量茂盛，花瓣紅色或紅紫色，花色苷含量較高，具有較大的研究和開發價值[3-4]。

目前已有文獻報道紅花羊蹄甲花瓣花色苷的提取方法[5-7]、成分鑒定和抗氧化活性[8]，花瓣乙醇提取物抑菌活性[9]、水提取物毒理學研究[10]，但鮮見有采用pH示差法對紅花羊蹄甲花瓣中花色苷含量進行測定的相關研究報道。

pH示差法被廣泛應用于測定植物中花色苷的含量，其原理為花色苷的結構轉換成pH的函數，而干擾

物質的特征吸收光譜不受pH的影響，該方法具有準確度較高、重現性好、操作方法簡便、對儀器設備要求低、便于推廣等優點[11]。因為不同植物材料來源花色苷的組成不同，所以需要建立適合于測定紅花羊蹄甲花瓣中花色苷含量的pH示差法，對測定過程中反應平衡條件進行優化[12-15]。研究擬進行pH示差法測定紅花羊蹄甲花瓣中花色苷含量的方法學研究，以期為紅花羊蹄甲花瓣乃至其它植物中花色苷的定量分析提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

原料：紅花羊蹄甲花瓣采自廣西壯族自治區來賓市廣西科技師范學院校園內道路兩旁，將花瓣陰干，粉碎后過80目篩，存儲于干燥避光處，備用。

試劑：檸檬酸、檸檬酸三鈉，濃鹽酸、氯化鉀、冰醋酸、乙酸鈉、無水乙醇均為分析純試劑，北京化工；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品（純度≥98%，批號：yz180516，南京源植生物科技有限公司）；試驗過程中使用的水均為去離子水。

儀器與主要設備：中草藥粉碎機（FW-135，天津市泰斯特儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計[UV-2600，島津企業管理（中國）有限公司]；電子分析天平（FA-2004B，上海越平科學儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（R-1001VN，鄭州長城科工貿有限公司）；實驗室微波合成儀（XH-MC-1，北京翔鵠科技發展有限公司）；循環水式多用真空泵（SHB-IIIG，鄭州長城科工貿有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-S4，金壇市醫療儀器廠）。

1.2 技術路線

準備花瓣材料→花色苷的提取→確定最大吸收波長→確定緩沖液pH→確定反應平衡溫度和平衡時間→精密度試驗→回收試驗

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

根據試驗條件所需配制不同pH的緩沖液，其中pH為3.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液配制方法見表1。

表1 檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液的配制（pH 3.0～6.0）

pH為0.6～2.0的緩沖溶液：向0.1 mol·L-1檸檬酸溶液中逐滴加入鹽酸，輔以pH計校正配制。pH為1.0的緩沖溶液：V（0.2 mol·L-1HCl）∶V（0.2 mol·L-1KCl）=25∶67；pH為4.5的緩沖溶液：V（0.2 mol·L-1HAc）∶V（0.2 mol·L-1NaAc·3H2O）=1∶1。酸性乙醇溶液：V（75%乙醇）∶V（1.5 mol·L-1鹽酸溶液）=97∶3。

1.3.2 花瓣花色苷的提取

參照文獻[4]的方法并稍作改動。準確稱取2.0 g花瓣粉末置于250 mL磨口三角燒瓶中。按料液比1∶30（g/mL）加入60 mL酸性乙醇提取液，置于微波合成儀中，連接冷凝管。600 W功率微波下處理90 s，抽濾，減壓濃縮至20 mL，用pH為3.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液定容至100 mL，即得花瓣花色苷提取液。

1.3.3 花瓣花色苷含量測定

分別準確移取1.0 mL提取液于2支10 mL具塞試管中，分別用pH為1.0、4.5的緩沖溶液定容至10 mL，在40 ℃水浴中反應平衡50 min。以去離子水作為空白對照，用紫外-可見光分光光度計分別測定待測液在535 nm和700 nm處的吸光度，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計，利用 Fuleki公式（1）和（2）對待測液中花色苷含量進行計算[16]。

式中：ΔA為花色苷總吸光度；A535nm為花色苷在535 nm處的吸光度；A700nm為花色苷在700 nm處的吸光度；X為花瓣中花色苷的含量，mg·g-1；V為提取液總體積，mL；DF為稀釋倍數；M為Cy-3-O-Glu的摩爾質量（449.2 g·mol-1）；ε為Cy-3-O-Glu的消光系數（29 600 L·mol-1·cm-1）；L為光程，數值1 cm；m為樣品質量，g。

1.3.4 確定最大吸收波長

取一定量的花瓣花色苷提取液，用pH為3.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液稀釋至適當濃度，用紫外-可見分光光度計在可見光波長400～720 nm范圍內進行吸收光譜掃描，根據獲得的吸收光譜圖來確定最大吸收波長。

1.3.5 確定緩沖液pH

準確吸取2.0 mL提取液于11支10 mL具塞試管中（注：提取液加入體積不得超過待測液總體積的20%，否則將超過緩沖液的緩沖范圍），依次分別加入pH為0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，4.5，5.0和6.0的緩沖液定容至10 mL，以去離子水為空白對照。將待測液在已確定的最大吸收波長處測定吸光度，繪制以pH為橫坐標、吸光度為縱坐標的pH-吸光度曲線圖，以待測液在2個pH處吸光度的差值最大且在所選定的2個pH附近吸光度變化不大為原則確定緩沖液pH。

1.3.6 確定反應平衡溫度和平衡時間

準確吸取8.0 mL提取液于6支50 mL具塞試管中，以3支為一組分別用已選定的2個pH緩沖液定容至50 mL。以2支裝有不同pH緩沖液的具塞試管為一組，共分為3組，分別置于20，30和40 ℃水浴中進行反應平衡，每隔10 min在最大吸收波長處測定吸光度，觀測溶液吸光度在各反應溫度內隨反應平衡時間的變化情況，確定反應平衡溫度和平衡時間。

1.3.7 精密度試驗

取花瓣花色苷提取液，按1.3.3中的測定方法進行6次平行測定。

1.3.8 回收試驗

取兩份花瓣花色苷提取液，其中一份花色苷提取液按1.3.3中的測定方法直接測其含量，另一份花色苷提取液中加入已知量的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品，按1.3.3中的測定方法測定其含量，將兩份樣品所得的花色苷含量進行比較，按公式（3）計算加樣回收率。

式中：p為加樣回收率，%；m1為未加標試樣花色苷含量，mg·g-1；m2為加標試樣花色苷含量，mg·g-1；m3為加標量，mg·g-1。

1.4 數據處理

用Microsoft Office Excel 2007軟件對數據進行處理；用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖1可知，在400～720 nm可見光譜范圍內，提取液的吸光度變化呈現出先增大后減小的趨勢，即吸收光譜圖中只存在唯一的峰值，可以看出最大吸收波長為535 nm。由于花色苷的最大吸收區在500～540 nm波長范圍內，說明提取液中存在花色苷類物質[17]。

圖1 樣品的吸收光譜

2.2 緩沖液pH的確定

花色苷的四種結構在溶液中的存在形式取決于溶液的pH，這四種結構在一定的pH溶液中存在著平衡。（1）當溶液pH較小時以紅色的花烊正離子形式存在，此時溶液為深紅色；（2）隨著溶液pH的升高，溶液逐漸變淺，此時花色苷以無色甲醇假堿或查爾酮形式存在；（3）當pH最高時以藍色的醌式堿形式存在，溶液為深藍色[18]。綜上所述，pH的選定能影響花色苷定量分析的準確性與靈敏度，在選定溶液pH時應考慮的因素為：兩個pH下花色苷的吸光度的差異顯著且結構穩定；單一pH的輕微變動對花色苷吸光度的影響是極小的。

因為花色苷只在酸性介質中可以保持穩定，因而試驗中只測定酸性介質中不同pH條件下花色苷提取液在最大吸收波長處的吸光度變化。如圖2所示，花瓣花色苷在pH 1.0和4.5處的吸光度之間的差值最大，且在pH 1.0和4.5 附近其吸光度變化不大，滿足試驗要求，因此確定緩沖液pH為1.0和4.5。

2.3 反應平衡溫度和平衡時間的確定

花色苷結構之間的轉換平衡受溶液pH的影響，因此提取液用緩沖溶液進行稀釋時，原有的平衡發生轉移，必須靜置一段時間達到新的平衡狀態后才能測定吸光度。溶液的溫度影響反應平衡所需要的時間，溶液溫度越高所需要的時間就越少，但花色苷在高溫環境中穩定性變差，所以反應平衡溫度應控制在40 ℃以下[12]。

如圖3和圖4所示，在不同緩沖溶液中，吸光度隨反應時間的延長所體現出的變化趨勢是不同的。在pH為1.0的緩沖溶液中，吸光度隨著時間的延長先呈增大的趨勢、穩定后又緩慢減小。在pH為4.5的緩沖溶液中，吸光度呈減小的趨勢，穩定后又下降。在相同pH的緩沖溶液中，不同的平衡溫度下達到新平衡所需要的時間有差異，總體來說，平衡溫度越高所需要的時間就越短。綜上所述，確定反應平衡溫度為40 ℃，時間為50 min。

圖2 樣品在不同pH下的吸光度

圖3 不同平衡溫度下吸光度隨時間的變化（pH為1.0）

圖4 不同平衡溫度下吸光度隨平衡時間的變化（pH為4.5）

2.4 精密度試驗

從表2可知，采用pH示差法測得紅花羊蹄甲花瓣中花色苷的含量為10.401 mg·g-1，相對標準偏差為1.17%，表明該方法具有良好的精密度。

2.5 回收試驗

測定結果如表3所示，應用pH示差法測定花瓣中花色苷含量，測定的平均加標回收率為100.77%，RSD為1.76%，表明該方法準確可靠，可用于花瓣花色苷含量的實際測定。

3 結論

利用pH示差法測定紅花羊蹄甲花瓣花色苷的含量，并對測定條件進行了分析。結果表明：紅花羊蹄甲花瓣中花色苷的最大吸收波長為535 nm，符合花色苷的特征吸收峰所在的波長范圍，故確定測定波長為535 nm。測定吸光度所用緩沖液pH為1.0和4.5，反應平衡溫度為40 ℃，反應平衡時間為50 min。精密度試驗結果得到樣品中花色苷含量為10.401 mg·g-1，相對標準偏差為1.17%。加標回收法測得平均回收率為99.36%，相對標準偏差為1.69%。總之，采用pH示差法進行定量分析，具有操作簡便、準確度高、靈敏性好等優點，能有效消除花瓣在干燥過程中產生的褐色降解物對測定結果的干擾，適合于紅花羊蹄甲花瓣花色苷含量的定量分析。