HPLC法測(cè)定果汁和葡萄酒中的三種紅色合成色素

呂小麗，朱春燕，陳林，郭平*

1. 江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（南昌 330001）；2. 贛州市全標(biāo)生物科技有限公司（贛州 341100）

合成色素多由苯、甲苯等為原料合成，往往含有重氮、苯環(huán)、氧雜蒽等結(jié)構(gòu)，對(duì)人體存在致癌等隱患[1]。目前，國(guó)際上允許使用的合成著色劑已由過(guò)去的上百種降至二十余種，如美國(guó)只批準(zhǔn)使用7種，日本也只有11種[2]。但目前在很多國(guó)家和地區(qū)，合成色素并沒(méi)有被完全禁止使用，因此對(duì)合成色素的檢測(cè)仍然是食品檢測(cè)的一個(gè)重點(diǎn)[3]。

目前報(bào)道的對(duì)食品中色素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[5-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法[9-10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]、毛細(xì)管電泳法[12]和免疫PCR法[13]等。但是已報(bào)道的對(duì)果汁和葡萄酒中著色劑的檢測(cè)多限于檸檬黃、誘惑紅、日落黃等常見(jiàn)色素的檢測(cè)，而對(duì)于同時(shí)測(cè)定果汁和葡萄酒中的赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅這三種紅色色素的研究較少，并且這些檢測(cè)方法的樣品凈化過(guò)程一般都采用聚酰胺吸附法或是直接稀釋法等，它們具有操作費(fèi)時(shí)繁瑣、有機(jī)試劑消耗量大、基質(zhì)干擾嚴(yán)重、回收率低等特點(diǎn)。鑒于此，試驗(yàn)采用弱陰離子固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，基于高效液相色譜（HPLC）分離技術(shù)，對(duì)赤蘚紅、孟加拉玫瑰紅和熒光桃紅3種色素進(jìn)行檢測(cè)。該方法分離度高、基質(zhì)干擾小、靈敏度高、快速準(zhǔn)確，可為果汁和葡萄酒中非法添加或超標(biāo)添加的合成色素的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；Vortex-Genie2渦旋混勻器（美國(guó)Scientific Industries公司）；KQ.600B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；R-215旋轉(zhuǎn)濃縮儀（瑞士BUCHI公司）；N-EVAP氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；G-16高速離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸銨均為色譜純；氨水、乙酸為分析純；水為Millipore超純水；標(biāo)準(zhǔn)品：赤蘚紅（Erythrosine），CAS登錄號(hào)16423-68-0，純度≥90%；熒光桃紅（Phloxine B），CAS登錄號(hào)18472-87-2，純度≥90%；孟加拉玫瑰紅（Rose bengal），CAS登錄號(hào)632-69-9，純度≥90%；弱陰離子固相萃取柱為Strata X-AW SPE（6 mL，200 mg），使用前依次用6 mL甲醇和6 mL水活化。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量（10.00 mg左右）的赤蘚紅、孟加拉玫瑰紅和熒光桃紅標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，在-18 ℃以下避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，混合，用甲醇將濃度稀釋至50.0 μg/mL混標(biāo)，在-18 ℃以下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用前取適量上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用50%甲醇溶液稀釋至0.25，0.50，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品來(lái)源

果汁和葡萄酒樣品均為市售樣品。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Z0RBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.04 mol/L乙酸銨；梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積20 μL，波長(zhǎng)540 nm。

σ收斂是指不同經(jīng)濟(jì)體間某一變量值的標(biāo)準(zhǔn)差隨時(shí)間的推移而逐漸下降，用來(lái)反映該變量值的平均離散程度。本文基于標(biāo)準(zhǔn)差的估計(jì)方程理論，構(gòu)建地價(jià)、房?jī)r(jià)和物價(jià)的σ收斂模型，分析35個(gè)大中城市的地價(jià)、房?jī)r(jià)和物價(jià)的靜態(tài)差距。σ收斂檢驗(yàn)方程為：

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.6 樣品前處理方法

1.6.1 提取

稱(chēng)取2 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 1%氨水-甲醇（1∶1，V/V）溶液，混勻，超聲提取10 min，用10%乙酸調(diào)pH約6.0，待凈化。

1.6.2 凈化

將所得待凈化溶液全部轉(zhuǎn)移至活化好的弱陰離子固相萃取柱中，再依次用6 mL 0.02 mol/L乙酸銨溶液、6 mL 80%甲醇溶液淋洗小柱，棄去淋洗液，用10 mL 10%氨水-甲醇（1∶1，V/V）溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液先旋蒸再于50 ℃下氮?dú)獯抵?.5 mL左右，加50%甲醇定容至2.0 mL，超聲2 min，混勻后，于14 000 r/min離心10.0 min，取上清液，供高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將赤蘚紅、孟加拉玫瑰紅和熒光桃紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用50%甲醇溶液分別配制成10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二極管陣列檢測(cè)器在300～800 nm范圍掃描。赤蘚紅最大吸收波長(zhǎng)為530 nm，熒光桃紅最大吸收波長(zhǎng)為546 nm，孟加拉玫瑰紅最大吸收波長(zhǎng)為556 nm。當(dāng)波長(zhǎng)為530 nm時(shí)，赤蘚紅響應(yīng)值為22.5 mAU，熒光桃紅響應(yīng)值為26 mAU，孟加拉玫瑰紅響應(yīng)值為21 mAU；當(dāng)波長(zhǎng)為540 nm時(shí)，赤蘚紅響應(yīng)值為14.5 mAU，熒光桃紅響應(yīng)值為38 mAU，孟加拉玫瑰紅響應(yīng)值為39 mAU；當(dāng)波長(zhǎng)為550 nm時(shí)，赤蘚紅響應(yīng)值為4 mAU，熒光桃紅響應(yīng)值為78 mAU，孟加拉玫瑰紅響應(yīng)值為39 mAU；綜合考慮三者情況，最終選擇540 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜柱的選擇

赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅均為水溶性物質(zhì)，極性較強(qiáng)，色譜柱類(lèi)型應(yīng)選反相色譜柱，試驗(yàn)使用了三種不同類(lèi)型的C18柱對(duì)三種色素進(jìn)行分離，分別是Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）、Waters Xbridge C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）和Waters SunFire C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）。

結(jié)果顯示：采用Waters Xbridge C18色譜柱，三種物質(zhì)的峰形都有明顯的拖尾現(xiàn)象；在Waters SunFire C18色譜柱中，孟加拉玫瑰紅的峰形有略微拖尾，且三種物質(zhì)在該柱子上的響應(yīng)值沒(méi)有Agilent ZORBAX SB C18柱的高，因此最終選擇的色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.3.1 直接稀釋法測(cè)定與SPE柱凈化法比較

文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道，測(cè)定葡萄酒和果汁中色素時(shí)，可直接稀釋測(cè)定，同時(shí)隨著現(xiàn)代固相萃相技術(shù)的普及，色素的凈化方式也可采用固相萃取柱凈化，根據(jù)赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅三種色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，適合用弱陰離子交換柱對(duì)其進(jìn)行凈化。取5.0 g陰性的葡萄酒試樣和5.0 g陰性的果汁試樣，添加三種色素混標(biāo)，添加量為10.0 μg/g，再用水定容至25 mL。混勻后，離心5 min，用高效液相色譜法測(cè)定，再取5.0 g陰性的葡萄酒試樣和5.0 g陰性的果汁試樣，添加三種色素混標(biāo)，添加量為10.0 μg/g，調(diào)pH至6.0，過(guò)X-AW柱后，濃縮、定容后用高效液相色譜法測(cè)定。果汁和葡萄酒試樣中的赤蘚紅、熒光桃紅、孟加拉玫瑰紅的直接稀釋法測(cè)定與SPE柱凈化后測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。果汁和葡萄酒用直接稀釋法測(cè)定時(shí)，因樣品無(wú)凈化過(guò)程，回收率偏低，而果汁和葡萄酒中赤蘚紅、熒光桃紅、孟加拉玫瑰紅用X-AW柱凈化后，回收率明顯提高。故選用弱陰離子交換固相萃取柱對(duì)樣品提取溶液進(jìn)行凈化。

表2 直接稀釋法測(cè)定與SPE柱凈化法測(cè)定結(jié)果比較

2.3.2 提取溶液的選擇

分別取兩份10.0 g陰性的葡萄酒試樣和10.0 g陰性的果汁試樣，添加待測(cè)物，使其濃度為0.1 μg/g，分別加入10 mL水和10 mL甲醇-1.0%氨水（1+1），超聲10.0 min，用10%乙酸調(diào)pH至6.0，過(guò)X-AW柱，濃縮、定容后用高效液相色譜法測(cè)定。果汁和葡萄酒樣品中的赤蘚紅、熒光桃紅、孟加拉玫瑰紅用水和甲醇-1.0%氨水（1+1）提取的結(jié)果見(jiàn)表3。果汁和葡萄酒中的赤蘚紅、熒光桃紅、孟加拉玫瑰紅用甲醇-1%氨水（1+1）提取，其回收率明顯比用水提取的高。因此選擇甲醇-1%氨水（1+1）溶液作為提取溶劑。

表3 不同提取溶液的提取效果結(jié)果比較

2.3.3 上機(jī)前過(guò)膜與高速離心效果比較

考慮到微孔濾膜可能對(duì)色素會(huì)有吸附作用，試驗(yàn)比較了上機(jī)前過(guò)膜或高速離心的方式對(duì)三種色素的影響。取兩份質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混標(biāo)。體積為1 mL，一份高速離心后上機(jī)檢測(cè)，一份過(guò)膜后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。過(guò)膜對(duì)三種待測(cè)物有影響，其中對(duì)孟加拉玫瑰紅的影響最大，其回收率下降近50%，說(shuō)明濾膜會(huì)對(duì)色素有吸附，導(dǎo)致回收率下降。故采用高速離心后上機(jī)檢測(cè)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法線性范圍和定量限

取50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋至0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/mL七個(gè)濃度。按照上述色譜條件進(jìn)樣，以各物峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X（μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)譜圖見(jiàn)圖1，線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5。

由表5可知，赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅在0.1～10.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)添加水平為0.50 mg/kg時(shí)，信噪比（S/N）大于10，可滿足定量檢測(cè)要求，因此確定方法的定量限為0.50 mg/kg。

表4 離心與過(guò)膜試驗(yàn)對(duì)比

圖1 三種混標(biāo)圖譜

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性回歸系數(shù)

2.4.2 回收率和精密度

采用向陰性樣品中添加待測(cè)物的方式進(jìn)行方法學(xué)評(píng)估。以不含赤蘚紅、熒光桃紅、孟加拉玫瑰紅色素的果汁、葡萄酒為空白樣品基質(zhì)，添加0.5，1.0和2.0 mg/kg三個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平進(jìn)行10次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得的赤蘚紅、熒光桃紅、孟加拉玫瑰紅的回收率和精密度見(jiàn)表6。回收率在86.56%～101.90%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.07%～6.44%之間，符合殘留檢測(cè)的要求，可見(jiàn)該法回收率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定果汁和葡萄酒中赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅三種紅色色素的高效液相色譜法，并確定了前處理?xiàng)l件和色譜條件。樣品用1%氨水-甲醇溶液（1+1）超聲提取，經(jīng)弱陰離子固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果顯示：赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅在0.1～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 9。各色素在0.5，1.0和2.0 mg/kg的樣品加標(biāo)條件下回收率為86.56%～101.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.07%～6.44%。該方法具有前處理簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于果汁和葡萄酒中赤蘚紅、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的測(cè)定。