銀樺葉不同溶劑提取物的抗氧化活性

張勇，張聲源，黃思涵，林大都*

嘉應學院醫學院（梅州 514031）

銀樺（Grevillea robusta A. Cunn. ex R. Br.）為山龍眼科（Proteaceae）銀樺屬（Grevillea）常綠高大喬木，其葉子對有毒氣體如二氧化硫、氟化氫和氯化氫等有較強抗性，是理想的城市綠化樹種[1]。銀樺為山龍眼科植物，存在多種類型的化學成分，醫用價值較高；含有多種生物活性，在抗腫瘤、抗病毒和抗阿爾茨海默病等藥物方面做出貢獻[2]。中醫認為，樺樹液可祛痰止咳，清熱解毒，主治咳嗽、氣喘、小便赤澀；樺樹皮內用可清熱利濕解毒，外用治燒燙傷，癰癤腫毒。銀樺果實中還含有具有鎮靜作用的豆腐果苷，可用于神經衰弱及血管神經性頭痛等病癥的治療。不僅如此，銀樺樹中含有豐富的化學營養物質[3]，譬如各種氨基酸和微量元素，維生素等。Kallio等[4]對芬蘭銀樺樹液進行一系列試驗，試驗結果表明此銀樺樹液無誘變性和毒性，作為綠色食品原料前景廣闊。現代研究結果表明[5-8]，銀樺中含有多種酚類物質，具有一定抗瘧活性與抗癌活性。國內對銀樺葉不同極性部位的抗氧化活性研究尚未見報道。因此，采用普魯士藍法、DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法對銀樺葉甲醇提取物及其不同極性萃取部位的體外抗氧化能力進行評價，旨在為銀樺葉的綜合開發和有效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

銀樺葉（采自嘉應學院醫學院杏林天然藥物園）；DPPH（北京索萊寶科技有限公司）；ABTS（蘇州郎行生物科技有限公司）；VC對照品（純度≥98%）、十二水合磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、二水合磷酸二氫鈉、三氯乙酸（西隴科學股份有限公司）；其他試劑

[14] DONG W J, ZHAO J P, HU R S, et al. Differentiation of Chinese Robusta coffees according to species, using a combined electronic nose and tongue, with the aid of chemometrics[J].Food Chemistry, 2017, 229: 743-751.

[15] YU P, YEO A S, LOW M, et al. Identifying key nonvolatile compounds taste profile in ready-to-drink green tea and their impact on taste profile[J]. Food Chemistry, 2014,均為分析純。

1.2 儀器與設備

JP-100S超聲波清洗機（深圳市杰蒙清洗設備有限公司）；AUW220D電子微量天平（日本島津公司）；BT125D電子分析天平、D-16C離心機（德國Sartorius公司）；78-0070旋轉蒸發儀（美國KD公司）；UV5紫外-可見分光光度計（瑞士METTLERTOLEDO公司）；DU-20電熱恒溫油浴鍋（鄭州南北儀器設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

采集1.5 kg新鮮銀樺葉，預處理后剪碎，用3 000 mL甲醇超聲（37 ℃，30 min）提取2次，合并提取液，減壓濃縮得銀樺葉甲醇提取物（總浸膏），代號為GR-T（68 g）。取50 g總浸膏，加水懸浮，移置1 000 mL分液漏斗中，依次用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，保留水層，減壓濃縮后，得正丁醇萃取物、代號為GR-B（12 g），乙酸乙酯萃取物、代號為GR-E（13 g），石油醚萃取物、代號為GR-P（5 g），水提物、代號為GR-W（10 g），所有樣品均冷藏備用。

1.3.2 體外抗氧化活性評價

1.3.2.1 還原能力的測定

參照楊陽等[9]的方法，并做適當改進。將2.5 mL不同質量濃度的樣品溶液精確移取到10 mL試管中，并分別加入2.5 mL磷酸緩沖液（2.0 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，搖勻，50 ℃恒溫水浴20 min，取出急速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液。將上述溶液離心10 min（6 000 r/min），取2.5 mL上清液，再加入2.0 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1% FeCl3，混勻，靜置10 min后于700 nm測定吸光度。將VC溶液用作陽性對照組，平行測定3次，獲得平均值。

1.3.2.2 清除DPPH·能力測定

參照孫崇魯等[10]的方法，并做適當改動。取100 μL不同質量濃度的樣品溶液，分別將其加入3.9 mL 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液中，暗室反應30 min，以無水乙醇溶劑作空白對照，測定波長517 nm處的吸光度（Ai）；將3.9 mL 0.2 mmol·L-1DPPH無水乙醇溶液與100 μL無水乙醇混合后，測定波長517 nm處的吸光度（A0）；測定3.9 mL無水乙醇溶液與100 μL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度（Aj）。將VC溶液用作陽性對照組，平行測定上述試驗3次，獲得平均值。根據式（1）計算出樣品和VC對DPPH·清除率。

1.3.2.3 清除ABTS+·能力測定

參照陳磊等[11]的方法，并做適當的修改。將100 μL不同質量濃度的樣品溶液加入到3.9 mL ABTS+·溶液中并精確搖動30 s，室溫靜置10 min，測定波長734 nm處的吸光度（Ai）；測定3.9 mL ABTS+·溶液與100 μL無水乙醇混合后在波長734 nm處的吸光度（A0）；測定3.9 mL無水乙醇與100 μL樣品溶液在波長734 nm處的吸光度（Aj）。將VC溶液用作陽性對照組，平行測定上述試驗3次，獲得平均值。根據式（2）計算出樣品和VC對ABTS+·清除率。

2 結果與分析

2.1 還原能力測試結果

由圖1和表1～表3可知，銀樺葉不同溶劑提取物均表現出不同程度的還原能力，且還原能力在試驗濃度范圍內隨溶液濃度的增加而增強，呈正相關性，但還原能力均小于VC。在相同質量濃度下，GR-E的鐵還原力最強，其次是GR-T。各提取物還原能力大小依次為：VC＞GR-E＞GR-T＞GR-B＞GR-W＞GR-P。

圖1 銀樺葉各溶劑提取物還原能力

表1 VC對鐵還原力的測定結果

表2 銀樺葉各溶劑提取物對鐵還原力的測定結果

表3 銀樺葉各溶劑提取物對鐵還原吸光度的回歸分析

2.2 清除DPPH·的測試結果

由圖2、表4和表5可知，在一定質量濃度范圍內，銀樺葉各溶劑提取物對DPPH·均有良好清除作用，隨著試驗質量濃度增大，測得的吸光度減小，其對DPPH·清除作用逐漸增強。由表6可知，GR-T、GR-E清除DPPH·作用較強，IC50值分別為0.025 7和0.026 4 mg/mL，根據IC50值評價測定，IC50值越小，表示清除DPPH·能力越好。各提取物清除DPPH·能力強弱依次為：VC＞GR-T＞GR-E＞GR-B＞GR-W＞GR-P。

圖2 銀樺葉各溶劑提取物對DPPH·的清除能力

表4 VC對DPPH·清除率的測定結果

表5 銀樺葉各溶劑提取物對DPPH·清除率的測定結果

表6 銀樺葉各溶劑提取物對DPPH·清除率的回歸分析

2.3 清除ABTS+·的測試結果

由圖3、表7和表8可知，銀樺葉各溶劑提取物對ABTS+具有一定清除能力，質量濃度為0.2 mg/mL時，GR-T對ABTS+·清除率達59.17%，GR-W清除率最低，僅17.42%，各提取物清除ABTS+·能力強弱依次為：VC＞GR-T＞GR-E＞GR-B＞GR-P＞GR-W。由表9相關性分析可知，GR-T、GR-E、GR-B、GR-P、GR-W的質量濃度與清除率的相關系數（R2）分別為0.983 97，0.993 57，0.961 02，0.968 85和0.963 45，表明各提取物清除ABTS+·能力與質量濃度之間有良好相關性，且各提取物IC50均小于1 mg/mL，具有良好的抗氧化活性。

圖3 銀樺葉各溶劑提取物對ABTS+·清除能力

表7 VC對ABTS+清除率的測定結果

表8 銀樺葉各溶劑提取物對ABTS+·清除率的測定結果

表9 銀樺葉各溶劑提取物對ABTS+·清除率的回歸分析

3 討論

醫學研究證實，許多慢性疾病，包括心血管、消化、內分泌和呼吸，都與人體內積聚的過多自由基有關。研究表明，黃酮類、酚類、皂苷、多糖等多類中藥化學成分具有良好的抗氧化活性[12-13]，從天然藥物中尋找抗氧化劑來清除人體內的自由基將成為醫藥研發行業發展的潮流和趨勢。

采用普魯士藍法、DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法對銀樺葉不同溶劑提取物的抗氧化能力進行評價。結果表明，銀樺葉不同溶劑提取物均表現出不同程度的還原力和清除作用，并呈明顯的量效關系。其中，甲醇提取物、乙酸乙酯萃取物對鐵還原力和清除DPPH·、ABTS+·作用最強，提示銀樺葉抗氧化活性成分主要集中在醇提部位和乙酸乙酯部位，可作為探究銀樺葉抗氧化活性的主要極性部位進行深入研究。銀樺在中國廣泛分布，資源豐富，從中篩選抗氧活性較強萃取物，為銀樺葉抗氧化活性成分的提取分離及其天然抗氧化劑的開發利用提供研究的試驗數據，為銀樺葉在食品、藥品和保健品等領域的深入開發提供理論參考。

4 結論

在一定濃度范圍內，銀樺葉不同溶劑提取物的清除能力與樣品濃度呈良好的量效關系，其中甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物抗氧化活性最強。