限制性酶解燕麥蛋白功能特性和抗氧化活性

許英一，王彪，王宇，林巍，吳紅艷，余世鋒

1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省農科院畜牧獸醫分院（齊齊哈爾 161005）

目前，對燕麥蛋白的研究主要集中在不同提取方法及功能性質[3-5]，對燕麥蛋白酶解物的功能性質等問題研究很少，而對于不同水解度對燕麥蛋白酶解物功能特性及抗氧化活性的影響還未見報道。研究對堿提酸沉法得到的燕麥蛋白進行不同程度的限制性酶解，對不同水解度的燕麥蛋白酶解物的溶解性、乳化性等功能特性及抗氧化活性進行比較分析，以期獲得功能性和抗氧化性較好的燕麥蛋白酶解物，為燕麥蛋白的精深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

燕麥蛋白：堿提酸沉法制備。堿性蛋白酶：酶活力1.0×105U/g，上海源葉生物科技有限公司。十二烷基硫酸鈉（SDS）：美國Sigma公司。1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma公司。Amino Acids Mixture Standard Solution，Type H：日本Wako公司。其他化學試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

高速藥物粉碎機：WK-600A型，青州市精誠機械有限公司。高速組織搗碎機：DS-1型，上海標本模型制造廠。臺式低速離心機：TDL-5-A型，上海安亭科學儀器廠。pH計：PB-10型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，常州榮華儀器制造有限公司。可見分光光度計：722S型，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同水解度燕麥蛋白酶解物的制備

脫脂燕麥粉（80目）→加水溶解[料液比1∶8（g/mL）]→酶解（堿性蛋白酶，酶解溫度50 ℃，酶解時間分別為1.0，2.0，3.0和4.0 h，酶解pH 8.0，酶加量2 g/100 g底物）→滅酶（90 ℃，10 min）→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液→酸沉（pH 4.0）→沉淀凍干→燕麥蛋白酶解物

1.3.2 水解度DH的測定

水解過程中滴加0.5 mol/L NaOH溶液控制體系pH為最適值不變，用pH-Stat法[6]測定 DH，DH按式（1）計算：

式中：CNaOH為NaOH溶液的濃度，mol/L；VNaOH為消耗NaOH溶液體積，mL；Mp為底物中蛋白質質量，g；α為α-NH2的平均解離度；htot為每克蛋白中所含肽鍵總數，mmol/g蛋白質。

探頭置于不同位置，聲束的截面隨著聲束入射點至缺陷處的弧長而變化，調整相控陣探頭位置及聲束繪制的角度，使聲束覆蓋缺陷的最佳位置，采用超聲耦合劑進行無縫粘結，再進行聚焦延遲校準、靈敏度校準和DAC曲線校準等，以提高檢測的準確性與適用性。A、B處的人工缺陷定位結果如圖14、圖15。

1.3.3 pH對燕麥蛋白酶解物功能特性的影響

在不同pH（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0）條件下，以燕麥蛋白做陽性對照，對4種水解度的燕麥蛋白酶解物進行功能特性分析，測定溶解性、乳化性和乳化穩定性。

1.3.4 溶解性測定

參考文獻[7]進行測定。

1.3.5 乳化性和乳化穩定性

采用濁度法[8]進行測定。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測定

參考文獻[9]進行測定。

1.4 數據處理

所用試驗均重復3次，各試驗數據均以x±s表示。采用Excel和SPSS 19.0軟件對數據進行統計學處理。

2 結果與分析

2.1 不同水解度燕麥蛋白酶解物的制備

以堿性蛋白酶水解燕麥蛋白，通過限制性酶解制備不同水解度的酶解物，水解度隨時間0～80 min變化如圖1所示。從圖1可以看出，水解開始的前30 min隨著時間增加，堿性蛋白酶酶解燕麥蛋白的水解度（DH）急劇增大；30 min后DH增加變緩，這主要是因為堿性蛋白酶是一種專一性較強的酶[10]，有其特定的肽鍵作用位點，隨著水解的進行，蛋白底物中特定的肽鍵會越來越少。此外有部分蛋白酶會失活，并伴隨產物積累對酶的競爭性抑制，所以水解速度會越來越慢。水解60 min后，DH趨于平緩。水解過程中收集了4，8，20，40和60 min的酶解物，其DH分別為5%，10%，15%和20%。

圖1 堿性蛋白酶對燕麥蛋白的水解進程

2.2 燕麥蛋白酶解物溶解性

pH對不同水解度的燕麥蛋白酶解物的溶解性曲線如圖2所示。由圖2可知，不同水解度的酶解物的溶解性均高于未水解燕麥蛋白，這是因為水解過程中形成了極性更強的小分子肽，使酶解物的親水性增強，提高了溶解性[11]。同一pH下，隨著DH從5%增大到15%，溶解性逐漸增大，而在DH 20%時，溶解性相對較低，甚至pH為10和12時溶解性低于燕麥蛋白，這可能是因為水解度太大，可溶性小分子燕麥蛋白增加，這些小分子蛋白在高pH下變性，溶解性受到影響。在pH 4～6范圍內，燕麥蛋白及酶解物的溶解性均最低，高于或低于此pH范圍溶解性均升高，這種溶解性的變化趨勢與劉穎等[12]研究限制性酶解米糠蛋白溶解性的變化一致，這是由于等電點附近時，蛋白質分子所帶靜電荷少，分子間的靜電排斥作用減弱，蛋白質更易發生聚集、沉淀現象[13]。

圖2 pH對燕麥蛋白酶解物溶解性的影響

2.3 燕麥蛋白酶解物乳化性和乳化穩定性

pH對燕麥蛋白酶解物乳化性和乳化穩定性的影響如圖3和圖4所示。不同水解度的酶解物的乳化性和乳化穩定性均高于未水解燕麥蛋白，這是由于蛋白質乳化性與蛋白質分子表面的疏水基團及分子大小有關，隨著酶解反應的進行，燕麥蛋白結構發生了變化，疏水基團逐漸暴露，有利于與油滴的結合，從而提高了其乳化能力。隨著DH的增加，燕麥蛋白酶解物乳化性逐漸下降。這是因為乳化反應的作用機理是溶液吸附到油滴的表面，形成保護膜以防止液滴聚結。水解過程中的產物多數是小肽和氨基酸，盡管小肽在油水界面處吸附能力強，但不具有大分子蛋白質的折疊力，它們不能像大分子蛋白質一樣形成牢固的界面張力[14]。因此溶液的乳化性隨水解度提高而降低。燕麥蛋白經過堿性蛋白酶水解后乳化活性隨pH呈現先減小后增大的趨勢，等電點處乳化性最低；而乳化穩定性的變化規律正好相反。乳化性和乳化穩定性隨pH變化規律與李洋[5]的研究基本一致。這是因為在等電點處凈電荷為零，不存在同種電荷互斥，能促使高黏性膜的形成，利于乳狀液的穩定性，同時等電點時溶解性最低，也使其乳化活性降低。

圖3 pH對燕麥蛋白酶解物乳化性的影響

圖4 pH對燕麥蛋白酶解物乳化穩定性的影響

2.4 燕麥蛋白酶解物清除DPPH自由基活性

不同水解度的燕麥蛋白酶解物對DPPH自由基清除能力如圖5所示。由圖5可知，所有DH的酶解物對DPPH自由基都有清除作用，而且表現出明顯的劑量效應。未水解的燕麥蛋白對DPPH 自由基清除率幾乎為零，因此在圖中未標明。通過對數據統計分析可以得出DH 5%、DH 10%、DH 15%和DH 20%的燕麥蛋白酶解物濃度與清除率的回歸方程分別為y=10.23x+24.066（R2=0.995 3），y=10.445x+21.546（R2=0.993 8），y=11.25x+20.596 6（R2=0.988 5），y=5.905 5x+20.71（R2=0.991 2）；其半抑制質量濃度（IC50值）分別為6.274，6.145，6.050和5.640 mg·mL-1。即隨著DH增大，IC50值逐漸減小，說明抗氧化活性逐漸增大。酶解物對DPPH自由基清除能力隨著DH的提高而增強。這可能由于隨著水解度增大，游離的疏水性氨基酸會不斷解離出來，酶解物的抗氧化活性與其疏水性氨基酸的種類和數量有關，因此在試驗水解度范圍內，抗氧化活性隨DH的增加而增大。

圖5 不同水解度的燕麥蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率

3 結論

研究了水解度對燕麥蛋白酶解物功能特性和抗氧化活性的影響。結果表明，經過堿性蛋白酶的限制水解作用較未作用的燕麥蛋白的功能性質有了很大提高。燕麥蛋白酶解物的溶解度隨水解度增加而大幅提高，等電點處尤為明顯；乳化性隨水解度增加而降低，而乳化穩定性的變化規律與乳化活性相反。酶解物對DPPH自由基清除活性隨著水解度增加而變大。

綜上所述，燕麥蛋白經過限制性酶解作用，功能特性和抗氧化活性有了很大程度的提高，為今后燕麥蛋白及其酶解物在食品領域的研發及應用提供了新的思路。