化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

姜翠翠，董舒梅，邱松山*，周英彪

廣東石油化工學(xué)院果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心（茂名 525000）

糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的三大慢性疾病之一[1-2]。在治療2型糖尿病的藥物中，以阿卡波糖為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑通過(guò)延緩腸道對(duì)碳水化合物的消化吸收，進(jìn)而降低餐后血糖濃度，從而達(dá)到對(duì)血糖的控制[3]。但該類藥物常會(huì)引起腹瀉、胃腸脹氣、腹痛等不良反應(yīng)[4]，因而從天然藥用植物中尋找和開(kāi)發(fā)能有效治療糖尿病的藥物已成為新的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)很多黃酮糖苷類天然產(chǎn)物具有較好的降糖作用，Ezzat等[5]對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑進(jìn)行研究，結(jié)果表明在測(cè)定條件下所測(cè)試的黃酮類化合物比陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖對(duì)抑制α-葡萄糖苷酶活性更有效；Chen等[6]研究表明微囊藻葉中三種黃酮苷類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶均有較好的抑制作用，提示微生菌葉是開(kāi)發(fā)中草藥抗糖尿病藥物的候選藥物；Nguyen等[7]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高粱籽粒中黃酮苷對(duì)血凝有潛在抑制作用及對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用，其富含黃酮類化合物的提取物可視為對(duì)糖尿病具有有益作用的功能性食品。

化橘紅由蕓香科植物化州柚或柚的接近成熟或未成熟的外層果皮經(jīng)干燥加工而來(lái)，素有“南方人參”之稱，研究表明化橘紅富含多糖、黃酮、香豆素等多種生物活性成分，藥用價(jià)值較高[8-9]，其中柚皮苷類化合物是化橘紅的主要有效活性成分[10]，具有抑菌[11]、抗氧化[12]、抗病毒[13]等生物活性。化橘紅中的黃酮類物質(zhì)主要是柚皮苷、野漆樹(shù)苷及新橙皮苷等物質(zhì)，此類物質(zhì)一般以C6—C3—C6為基本碳架，分子中有1個(gè)酮式羰基結(jié)構(gòu)，分子上的酚羥基數(shù)目及位置對(duì)其物質(zhì)的生物活性有較大影響[14]。關(guān)于化橘紅中的柚皮苷抗氧化活性研究報(bào)道較多，而抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究較少，試驗(yàn)以化橘紅柚皮苷為研究對(duì)象，采用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率并分析其抑制類型，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響，同時(shí)測(cè)定其清除DPPH自由基能力，以期為化橘紅柚皮苷進(jìn)一步開(kāi)發(fā)功能食品或藥品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化橘紅柚皮苷的制備

柚皮苷的制備參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行，有改動(dòng)。取產(chǎn)自廣東化州楊梅鎮(zhèn)經(jīng)干燥的化橘紅，隔水蒸軟切片，粉碎，過(guò)40目篩，備用。取100 g過(guò)篩粉末，加入2 L 50%乙醇，超聲波輔助萃取50 min，超聲功率180 W，在60 ℃條件下提取1 h，萃取結(jié)束后過(guò)濾，晾干的濾渣再加入1 L 50%乙醇提取1 h，過(guò)濾收集濾液，合并2次濾液，減壓濃縮至200 mL，離心除去雜質(zhì)，在清液中加入95%乙醇進(jìn)行醇沉，0 ℃靜置24 h，過(guò)濾，冷凍干燥得精制柚皮苷，經(jīng)測(cè)定純度為92.5%，備用。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.20，美國(guó)Sigma公司）；4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，Mym Biologigal Technology Company）；阿卡波糖（Acarbose，50 mg/片，德國(guó)拜耳醫(yī)藥公司）；碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）；超純水。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

HH-A型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；UV-5100B紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；DGG-916A恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；NRY-1102C立式恒溫?fù)u床（上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；ME104型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；VC890C+數(shù)字多用表（西安北成電子有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)

參考程艷剛等[16]的方法進(jìn)行，有改動(dòng)。以PNPG為底物，利用α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG產(chǎn)生對(duì)硝基酚（PNP），以一定時(shí)間內(nèi)反應(yīng)體系中PNP含量變化來(lái)計(jì)算化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。以0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（PBS，pH 6.8）為溶劑，分別配制0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和2.5 mmol/L底物PNPG溶液，配制樣品濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10和0.12 mg/mL，備用。具體反應(yīng)體系：分別吸取1 500 μL pH 6.8的0.1 mol/L的PBS及250 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液于試管中，加入250 μL不同濃度的樣品溶液，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)10 min，加入250 μL 2.5 mmoL/L的PNPG溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)20 min，加入1 000 μL 0.2 moL·L-1的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，并于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記作A樣品。以PBS代替樣品，其它條件同A樣品，記作A對(duì)照。以PBS代替酶，其它條件同A樣品，記作A空白。以Acarbose為陽(yáng)性對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3次取平均值；根據(jù)式（1）計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率；應(yīng)用SPSS軟件計(jì)算樣品與Acarbose的IC50。

1.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)

在1.2.1的反應(yīng)體系中加入相應(yīng)的試劑，分別設(shè)定反應(yīng)過(guò)程中的反應(yīng)時(shí)間5，10，15，20，25和30 min，終止反應(yīng)后于405 nm處測(cè)定吸光度OD，根據(jù)式（1）計(jì)算抑制率，比較不同反應(yīng)時(shí)間化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制的影響。

1.2.3 抑制α-葡萄糖苷酶活性的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

在測(cè)定體系中保持α-葡萄糖苷酶濃度（0.2 U/mL）不變，改變PNPG濃度，分別設(shè)置5個(gè)不同PNPG濃度（1.0，1.5，2.0，2.5和5.0 mmol/L），3個(gè)不同化橘紅柚皮苷樣品濃度（0，0.04和0.08 mg/mL），按1.2.1 的方法測(cè)定吸光度，以底物濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，經(jīng)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，探討化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶作用分析

底物PNPG濃度（2.5 mmoL/L）不變，設(shè)置6個(gè)不同的α-葡萄糖苷酶濃度（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 U/mL），3個(gè)不同化橘紅柚皮苷樣品濃度（0，0.04和0.08 mg/mL），按1.2.1的方法測(cè)定，以酶濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，探討柚皮苷類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆。

1.3 化橘紅柚皮苷清除DPPH·能力

參考Bajpai等[17]清除DPPH自由基的方法，有改動(dòng)，分析柚皮苷樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力。取6支試管，分別加入2 mL 0.02 mmoI/L DPPH·甲醇溶液置于10 mL的試管中，依次加入2 mL濃度為0，0.02，0.04，0.06和0.08 mg/mL的柚皮苷樣品溶液，迅速混勻，避光37 ℃溫水浴30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：A0為空白對(duì)照樣品的吸光度；AX為待測(cè)溶液樣品的吸光度；AX0為樣品溶液加甲醇的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3遍，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，應(yīng)用SPSS軟件通過(guò)單因素方差（One-way ANOVA）分析進(jìn)行多組間比較，p＜0.05則認(rèn)為樣品間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力

采用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型檢測(cè)柚皮苷類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖酶活性的抑制能力，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在0.02～0.12 mg/mL濃度范圍內(nèi)化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度升高而逐漸增加，其抑制活性呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。Peng等[18]研究山奈酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制機(jī)理，結(jié)果表明山奈酚能夠插入α-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)，占據(jù)酶的催化中心，導(dǎo)致PNPG底物無(wú)法進(jìn)入并誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶的構(gòu)象變化。IC50值表示化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的能力，IC50值越小其抑制效果越好，通過(guò)回歸分析可知化橘紅柚皮苷與阿卡波糖的IC50分別為0.008和0.026 mg/mL，表明化橘紅柚皮苷具有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性，同時(shí)其抑制活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖（p＜0.05），這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的結(jié)果比較一致，柚皮苷分子具有類似的酚羥基及分子結(jié)構(gòu)，柚皮苷分子可能是通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)降血糖功效的。

圖1 化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用影響

探討不同作用時(shí)間柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，確定化橘紅柚皮苷對(duì)酶活性的抑制是否具有時(shí)間依賴性，結(jié)果如圖2所示。

化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用在前15 min，隨時(shí)間增加其抑制率明顯增加，但在15～20 min以后，其抑制率隨時(shí)間增加而趨于平緩，表明化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與作用時(shí)間有關(guān)，在20 min時(shí)其抑制率達(dá)到最大，抑制作用具有一定時(shí)間依賴性，這與文獻(xiàn)報(bào)道[19]的結(jié)果比較一致。

2.3 柚皮苷類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型

根據(jù)抑制劑與底物的結(jié)合關(guān)系，抑制類型可以分為3種：競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，基于不同濃度樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，無(wú)抑制劑組的線性回歸方程為：y=8.731 0x+4.891 0。0.04 mg/mL抑制劑組的線性回歸方程為：y=14.627 0x+4.824 7。0.08 mg/mL抑制劑組的線性回歸方程為：y=21.124 0x+4.879 8。R2均大于0.998 7。由線性回歸方程可知隨著化橘紅柚皮苷質(zhì)量濃度的增大，直線的橫軸截距變小，而縱軸的截距固定不變，即Km變大，Vm不變；底物濃度相同時(shí)，抑制劑濃度從0 mg/mL增加到0.08 mg/mL，反應(yīng)速率降低。由此可推斷化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，這與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的結(jié)果比較一致。

圖2 不同時(shí)間柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

圖3 柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用曲線

2.4 柚皮苷類物質(zhì)的抑制作用的可逆性分析

采用1.2.4的方法，進(jìn)一步判斷柚皮苷的抑制作用是否可逆，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在測(cè)定酶活體系中加入不同質(zhì)量濃度的化橘紅柚皮苷類物質(zhì)后，所得的直線均通過(guò)原點(diǎn)，且加入的化橘紅柚皮苷質(zhì)量濃度越大，直線斜率越低；由此可以推測(cè)化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的，這與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的結(jié)果較為一致。

尋找有效的天然提取物作為α-葡萄糖苷酶抵制劑具有重要的意義，研究表明天然產(chǎn)物中的黃酮類物質(zhì)對(duì)糖尿病及并發(fā)癥具有積極的防治作用，柚皮苷屬于黃酮中的一種活性物質(zhì)，柚皮苷類物質(zhì)不但具有顯著的抗氧化、清除自由基的能力，還具較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，研究表明楊梅中的黃酮類化合物與α-葡萄糖苷酶的相互作用力主要是疏水相互作用，通過(guò)混合型抑制表現(xiàn)較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，從而降低血糖值[3]，地錦草總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶具有顯著抑制作用，且其抑制活性呈現(xiàn)一定的劑量依賴[16]，另有研究表明五味子中總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性約60%，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制調(diào)節(jié)控制血糖的作用[21]，化橘紅柚皮苷分子中有類似的酮式羰基結(jié)構(gòu)，分子上的酚羥基位置與數(shù)目對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性影響較大[14]，碳原子的游離羥基可增強(qiáng)其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，因此化橘紅柚皮苷可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的良好來(lái)源。

圖4 化橘紅柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的可逆性分析

2.5 化橘紅柚皮苷對(duì)DPPH自由基清除能力

采用1.3的方法比較柚皮苷和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除能力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 柚皮苷和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除能力比較

從圖5可知，隨著柚皮苷濃度升高，樣品對(duì)DPPH自由基清除能力增強(qiáng)（p＜0.05），但在低濃度下柚皮苷對(duì)DPPH自由基的清除能力不明顯，其對(duì)自由基清除能力低于抗壞血酸，質(zhì)量濃度0.08 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率達(dá)到73.6%，高于相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除能力，表明0.08 mg/mL濃度的柚皮苷具有較好的DPPH自由基清除能力，這與文獻(xiàn)[17]的報(bào)道較為一致，因此可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)柚皮苷的抗氧化功效。

3 結(jié)論

化橘紅中的黃酮類物質(zhì)主要是柚皮苷、新橙皮苷及野漆樹(shù)苷等，此類物質(zhì)分子中有酮式羰基結(jié)構(gòu)，分子上的酚羥基位置及數(shù)目對(duì)其抑制α-葡萄糖苷酶的活性有較大影響。試驗(yàn)結(jié)果表明化橘紅中的柚皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。抑制曲線試驗(yàn)表明最大反應(yīng)速度隨化橘紅柚皮苷質(zhì)量濃度的變化而變化，柚皮苷類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用優(yōu)于阿卡波糖，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50為0.008 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照物阿卡波糖的IC50為0.026 mg/mL，且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)可逆型，同時(shí)0.08 mg/mL濃度的柚皮苷具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，因此化橘紅可作為天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑的良好來(lái)源，這為化橘紅柚皮苷的降血糖及抗氧化功能食品或藥品的開(kāi)發(fā)及利用提供思路。