金橘中金橘苷的純化工藝

黃華花，王明軍，呂詩詩，王圣江，王曉瑩

廈門市中藥生物工程重點實驗室/福建省中藥精加工與健康產品開發重點研究室/廈門醫學院藥學系（廈門 361023）

金橘是蕓香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的成熟果實，藥食同源，應用廣泛，常鮮食，也可制成果脯、罐頭、果糕、果汁飲料等食用[1-4]，甚至被開發成保健食品如金桔利口酒、金棗丹、金桔咀嚼片等[5-7]，金橘是一種具有很大開發潛力的藥用保健資源?，F代研究表明[8-12]，金橘具有抗炎鎮痛、化痰止咳、調節免疫、預防結石、解酒保肝、調節胃腸運動等作用，黃酮為其活性部位[13-14]，但具體的活性成分尚不明確，限制了金橘的深度開發利用。金橘苷僅在金橘中有過報道，為黃酮類成分，且含量最高，可能為金橘的活性成分。在前期對金橘中金橘苷的提取工藝進行研究基礎上，試驗采用硅膠柱色譜法對金橘苷進行分離純化，在單因素考察基礎上，以金橘苷提取率和純度為考察指標，以洗脫劑比例、上樣量、硅膠量、柱直徑為考察因素，利用Box-Behnken響應面法對金橘苷的純化工藝進行優化，該工藝可為金橘的深度研究及產業化應用提供技術參考和依據。

1 材料

1.1 材料與試劑

金橘，采集于廣西桂林陽朔，由廈門醫學院藥學系鮑紅娟副教授鑒定為Fortunella margarita（Lour.）Swingle的干燥成熟果實。切片，去核，陰干，粉碎，過60目篩，備用。

金橘苷對照品（批號Q14M10Q73839，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；柱層析硅膠（100～200目，青島海洋化工有限公司）；氯仿、甲醇、磷酸（均為分析純）；乙腈（色譜純）；超純水。

1.2 儀器與設備

H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D、BS224S型電子天平（德國Sartorius公司）。

2 方法與結果

2.1 金橘苷純化

2.1.1 粗品的制備

取金橘粉末40 g，按料液比1∶50（g/mL）加入90%甲醇，超聲（功率900 W，頻率40 kHz）處理30 min，濾過，濃縮至100 mL，即得。

2.1.2 純化方法

精密吸取一定體積的2.1.1的粗品于蒸發皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅膠，混勻，蒸干，粉碎，得負載樣品硅膠。稱取一定量硅膠（100～200目），濕法裝入一定直徑的層析柱內，干法上樣，加入大量一定比例的洗脫劑進行洗脫，按相同體積將洗脫液收集于事前已編好號的收集瓶內，回收溶劑，作為過柱后的各供試品。

2.2 金橘苷的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

取金橘苷對照品適量，精密稱定，加90%甲醇溶解并制成質量濃度0.262 5 mg/mL的對照品貯備液。吸取對照品貯備液4 mL置于25 mL量瓶中，加90%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

過柱前的供試品溶液的制備。取2.1.1的粗品0.5 mL，置于10 mL量瓶中，加90%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

過柱后的供試品溶液的制備。取2.1.2的供試品，精密加入90%甲醇1.5 mL溶解，濾過，即得。

2.2.3 色譜條件

圖1 UPLC色譜圖

色譜柱，Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15% A→45% A；5～8 min，15% A）；流速0.3 mL/min；檢測波長333 nm；進樣量2 μL。在此色譜條件下，理論板數按金橘苷計不低于5 000，相鄰峰間分離度均大于1.5，基線分離良好，色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關系考察

精密吸取2.2.1的對照品貯備液1，2，4，8和16 mL稀釋至25 mL，得系列標準品溶液。按2.2.3的色譜條件進樣分析，以峰面積對質量濃度（mg/mL）進行回歸分析，得回歸方程為Y=1.453×107X+1.088×104，r=0.999 9，線性范圍為10.5～168.0 μg/mL。

2.3 金橘苷提取率和純度計算

將2.2.2的各供試品溶液按2.2.3的色譜條件進樣分析，按面積歸一化法，將純度大于60%的各供試品溶液合并，計算提取率和純度。

式中：m為過柱后合并的純度大于60%的供試品溶液中金橘苷質量，mg；M為過柱前的供試品溶液中金橘苷質量，mg。

金橘苷的純度為合并的純度大于60%的供試品溶液按2.2.3的色譜條件進樣分析后，通過積歸一化所得的純度。

2.4 單因素設計試驗

2.4.1 洗脫劑對金橘苷提取率和純度的影響

精密吸取2.1.1的粗品2 mL，共5份，分別置于蒸發皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅膠，混勻，蒸干，粉碎，得負載樣品硅膠。稱取10 g硅膠，共5份，分別濕法裝柱（柱直徑1.5 cm），干法上樣，分別以氯仿-甲醇-水比例（1∶1∶0.1，2∶1∶0.1，3∶1∶0.1，4∶1∶0.1和5∶1∶0.1）進行洗脫，按相同體積收集洗脫液，回收溶劑，按2.2.2的方法制備過柱后的供試品溶液，按2.2.3的色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算金橘苷提取率和純度，結果見圖2。隨著洗脫劑中氯仿比例增加，金橘苷提取率和純度均不斷增加，其中洗脫劑比例1∶1∶0.1時，金橘苷提取率和純度均很低，洗脫劑比例5∶1∶0.1時金橘苷提取率和純度與比例4∶1∶0.1時差異不大，但洗脫速度很慢，消耗大量洗脫劑，因此確定洗脫劑比例2∶1∶0.1，3∶1∶0.1和4∶1∶0.1作為響應面的3個水平。

2.4.2 上樣量對金橘苷提取率和純度的影響

分別精密吸取2.1.1的粗品1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL共5份，置于蒸發皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅膠，混勻，蒸干，粉碎，得負載樣品硅膠。稱取10 g硅膠，共5份，濕法裝柱（柱直徑1.5 cm），分別將上述樣品干法上樣，加入氯仿-甲醇-水比例3∶1∶0.1的洗脫劑進行洗脫，按相同體積收集洗脫液，回收溶劑，分別按2.2.2的方法制備過柱后的供試品溶液，按2.2.3的色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算金橘苷提取率和純度，結果見圖3。隨著上樣量增加，金橘苷提取率和純度先增加后降低，且在上樣量2.5 mL時，達到最高值，因此確定上樣量2.0，2.5和3.0 mL作為響應面的3個水平。

圖2 洗脫劑對金橘苷提取率和純度的影響

圖3 上樣量對金橘苷提取率和純度的影響

2.4.3 硅膠量對金橘苷提取率和純度的影響

精密吸取2.1.1的粗品2 mL，共5份，分別置于蒸發皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅膠，混勻，蒸干，粉碎，得負載樣品硅膠。分別稱取5.0，7.5，10.0，12.5和15.0 g硅膠，濕法裝柱（柱直徑1.5 cm），干法上樣，加入氯仿-甲醇-水比例為3∶1∶0.1的洗脫劑進行洗脫，按相同體積收集洗脫液，回收溶劑，分別按2.2.2的方法制備過柱后的供試品溶液，按2.2.3的色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算金橘苷提取率和純度，結果見圖4。隨著硅膠量增加，金橘苷提取率和純度先增加后降低，且在硅膠量10 g時，達到最高值，因此確定硅膠量7.5，10.0和12.5 g作為響應面的3個水平。

2.4.4 柱直徑對金橘苷提取率和純度的影響

精密吸取2.1.1的粗品2 mL共5份，分別置于蒸發皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅膠，混勻，蒸干，粉碎，得負載樣品硅膠。稱取10 g硅膠5份，濕法裝于直徑分別為1，1.5，2.0，2.5和3.0 cm的層析柱內，干法上樣，加入氯仿-甲醇-水比例3∶1∶0.1的洗脫劑進行洗脫，按相同體積收集洗脫液，回收溶劑，分別按2.2.2的方法制備過柱后的供試品溶液，按2.2.3的色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算金橘苷提取率和純度，結果見圖5。隨著柱直徑增加，金橘苷提取率和純度逐漸降低，因此確定柱直徑1.0，1.5和2.0 cm作為響應面的3個水平。

圖4 硅膠量對金橘苷提取率和純度的影響

圖5 柱直徑對金橘苷提取率和純度的影響

2.5 Box-Behnken試驗設計及結果

2.5.1 Box-Behnken試驗設計

以單因素考察為基礎，確定了考察因素及各因素的取值，見表1。根據Box-Behnken進行響應面試驗設計，方案及結果見表2。

表1 因素與水平

2.5.2 綜合評分的計算

將表2中金橘苷提取率X1、金橘苷純度X2的數據進行線性插值處理Z=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）后計算綜合評分Y，結果見表3。

式中：Z1為金橘苷提取率變換后的指標值；Z2為金橘苷純度變換后的指標值。

2.5.3 響應面模型的建立及方差分析

運用Design Expert 8.0.6進行回歸分析，擬合得到綜合評分（Y）對A（洗脫劑比例）、B（上樣量）、C（硅膠量）和D（柱直徑）的回歸方程為：Y=0.73+0.21A-0.046B+0.11C-0.11D+0.020AB-0.087AC-0.15AD-0.041BC+0.056BD+7.283×10-3CD-0.078A2-0.052B2-0.11C2-0.14D2。對該模型進行方差分析，結果見表4。

由表4可知，該模型差異極顯著（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p=0.102 6，p＞0.05），R2=0.932 8，說明該模型擬合程度好，回歸方程適合用于檢驗結果?；貧w方程各項方差分析表明，一次項A、C、D的影響極顯著（p＜0.01），B的影響不顯著；二次項C2、D2的影響極顯著（p＜0.01），A2的影響顯著（p＜0.05），B2的影響不顯著；交叉項AD的影響極顯著（p＜0.01），AC的影響顯著（p＜0.05），AB、BC、BD、CD的影響不顯著。由F可知，4個因素對Y的影響大小依次為：A＞D＞C＞B。通過舍去不顯著項得到優化模型方程為Y=0.73+0.21A+0.11C-0.11D-0.087AC-0.15AD-0.078A2-0.11C2-0.14D2。

2.5.4 交互效應分析

為進一步考察4個因素中交互作用對綜合評分的影響，運用Design Expert 8.0.6軟件繪制三維曲線圖，其中AC、AD之間的交互作用對綜合評分的影響顯著，與方差分析的結論相一致，見圖6。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 變換后的指標值及綜合評分

表4 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

圖6 交互效應圖

2.5.5 最佳工藝條件的確定與驗證

Design Expert 8.0.6軟件分析得到金橘苷的最佳純化條件為洗脫劑比例4∶1∶0.1、上樣量2.06 mL、硅膠量10.56 g、柱直徑1 cm，在此條件下，金橘苷取率和純度的綜合評分為1.023 4。為檢驗所得工藝的可靠性，進行驗證試驗。為了實際操作方便，對驗證時的工藝條件四舍五入得洗脫劑比例4∶1∶0.1、上樣量2.1 mL、硅膠量10.6 g、柱直徑1 cm，在此條件下進行3次平行試驗，具體結果見表5。由結果可知，測得的金橘苷提取率和純度的綜合評分為1.000 5（RSD=1.09%，n=3），與預測值相比偏差為2.24%，二者比較接近，表明模型合理可靠，預測性好，可以采用此工藝對金橘苷進行純化。

表5 驗證試驗結果（n=3）

3 結論與討論

3.1 結論

試驗以單因素考察為基礎，利用響應面法設計優化金橘苷的純化工藝，得到4個因素對金橘苷提取率和純度影響的大小依次為：洗脫劑比例＞柱直徑＞硅膠量＞上樣量。優化所得最佳純化工藝條件為：氯仿-甲醇-水4∶1∶0.1、上樣量2.1 mL、硅膠量10.6 g、柱直徑1 cm。此工藝穩定、可靠，可較好地純化金橘苷，為金橘的深度研究及產業化應用提供技術參考和依據。

3.2 討論

3.2.1 粗品制備方法的確定

前期已對金橘中金橘苷的提取工藝進行了研究，以甲醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比為考察因素，采用響應面法優化金橘苷的提取工藝，所優化的提取工藝條件為：甲醇體積分數90%、料液比1∶50（g/mL）、超聲提取30 min、提取溫度25 ℃。因此，試驗以此條件進行粗品的制備。

3.2.2 硅膠目數的考察

在預試驗中，考察硅膠目數對金橘苷分離效果的影響，分別以100～200、300～400目硅膠為填料進行金橘苷的純化。結果發現，采用300～400目硅膠為填料時，洗脫劑的流速非常慢，洗脫時間長，且金橘苷提取率和純度與采用100～200目硅膠為填料時差異不大，因此，試驗采用100～200目硅膠為填料進行金橘苷的純化。

3.2.3 拌樣硅膠量的確定

在預試驗中，考察濕法上樣和干法上樣的效果，發現干法上樣金橘苷的純化效果較好，對干法上樣時拌樣硅膠量進行考察，分別考察1∶0.1，1∶0.3和1∶0.5（mL/g）的拌樣硅膠量。結果發現，拌樣硅膠量1∶0.1時，負載樣品硅膠太硬，粉碎困難，且損失較大，而拌樣硅膠量1∶0.5時，上樣后樣品層太厚，純化效果差，因此，試驗最終確定1∶0.3的拌樣硅膠量。