玫瑰茄花萼超微粉總花色苷提取工藝的優(yōu)化

劉國(guó)凌，郭紅輝*，劉永吉，范澤健

1. 韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院（韶關(guān) 512005）；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（東莞 523808）

玫瑰茄也被叫做山茄、洛神花等，學(xué)名Hibiscus sabdariffa Linn，Malvace Roselle，Roselle，是錦葵科木槿屬的一年生草本植物，有“植物紅寶石”的美譽(yù)；玫瑰茄較適合在亞熱帶以及熱帶地區(qū)種植，原產(chǎn)于非洲等熱帶地區(qū)，近年來(lái)在我國(guó)的東南沿海地區(qū)如福建、廣西、廣東等地有大面積種植[1]。玫瑰茄花萼中富含豐富的花色苷、分類、氨基酸、有機(jī)酸和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分[2]?；ㄉ兆鳛槊倒迩鸦ㄝ嗟闹匾钚猿煞种唬蔀閺V大學(xué)者的研究重點(diǎn)[3-4]。目前，已有大量研究表明玫瑰茄花萼中的花色苷具有降血壓[5]、降血脂[6-7]、抗腫瘤[8]以及抗氧化[9-10]等生理功效。而多數(shù)關(guān)于玫瑰茄花萼中總花色苷成分提取的報(bào)道[11-12]都是以玫瑰茄花萼為研究對(duì)象。

試驗(yàn)以玫瑰茄花萼超微粉為研究對(duì)象，采用浸提法提取總花色，以總花色苷含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化玫瑰茄總花色苷提取工藝，為玫瑰茄花萼超微粉在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄花萼（廣東韶關(guān)）；氯化鉀（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；鹽酸（AR，衡陽(yáng)市凱信化工試劑股份有限公司）；無(wú)水乙酸鈉（AR，天津市百世化工有限公司）；無(wú)水乙醇（AR，成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；YF2-2氣流式超微粉碎機(jī)（瑞安永歷制藥機(jī)械有限公司）；YP-B20002電子分析天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；1510酶標(biāo)儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；HH-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（金壇市華峰儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠）；PHS-3E pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；LS-POP（9）激光粒度儀（珠海歐美克儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰茄超微粉制備

新鮮玫瑰茄花萼在60 ℃下真空干燥至水分含量小于5%，先經(jīng)中藥粉碎機(jī)得粗粉后，再經(jīng)超微粉碎機(jī)處理制得玫瑰茄超微粉，密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 粒徑及離散度測(cè)定

參考許俊男等[13]的方法，通過(guò)激光粒度分析儀LS-POP（9）測(cè)定玫瑰茄粉粒徑并計(jì)算其離散度。

1.3.3 溶解性測(cè)定

參考凌曉等[14]的方法，測(cè)定玫瑰茄粉的溶解性。

1.3.4 花色苷吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

在200～800 nm下對(duì)玫瑰茄花色苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.5 花色苷含量的測(cè)定

參考Liu等[15]的方法，采用pH示差法測(cè)定玫瑰茄花色苷含量。

1.4 玫瑰茄花色苷提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)

稱取一定量（1±0.000 2 g/份）玫瑰茄超微粉，用不同體積分?jǐn)?shù)（50%，60%，70%，80%和90%）乙醇溶液以不同料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）在不同的溫度（45，50，55，60和65℃）下進(jìn)行浸提一段時(shí)間（60，80，100，120和140 min），離心分離得提取液，測(cè)其花色苷含量。考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度及浸提時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷提取率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

為獲得提取玫瑰茄花萼超微粉總花色苷的最佳工藝參數(shù)，在單因素的基礎(chǔ)上，以花色苷含量為考察指標(biāo)，以料液比、浸提溫度及浸提時(shí)間為考察因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，在提取溶劑體積分?jǐn)?shù)一定的條件下對(duì)玫瑰茄花色苷提取工藝的其他參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰茄粉粒徑及離散度

由表2可以看出，經(jīng)過(guò)超微粉碎后的玫瑰茄粉，粒徑減小到15.03±0.11μm（≤25 μm），符合超微粉的標(biāo)準(zhǔn)。隨著粒徑的減小，離散度也減小，表明玫瑰茄超微粉的顆粒大小分布更為均勻。

表2 玫瑰茄粉的粒徑及離散度

2.2 玫瑰茄粉溶解性

由圖1可以得知，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，玫瑰茄粗粉的溶解性為53.46%，超微粉的溶解性為66.85%；相較于玫瑰茄粗粉，超微粉的溶解性大大提高。這是由于同等質(zhì)量的玫瑰茄粉，超微粉碎后的玫瑰茄粉粒徑更小，比表面積更大；玫瑰茄超微粉與水分更充分接觸，溶解性增大。

圖1 55 ℃時(shí)玫瑰茄粗粉、超微粉的溶解性對(duì)比

2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

由圖2可見，玫瑰茄花色苷在270和520 nm處均存在吸收峰，符合在278 nm處附近和507～536 nm處范圍內(nèi)的花色苷特征吸收[16]，因此在可見光區(qū)選取520 nm作為玫瑰茄花色苷的最大吸收波長(zhǎng)。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間100 min的條件下，分別測(cè)定用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取出的玫瑰茄超微粉總花色苷含量，結(jié)果見圖3。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取液中的玫瑰茄花色苷含量顯著增大，在70%乙醇體積分?jǐn)?shù)下達(dá)到最大值723.94 mg/100 g；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%后，溶液極性減弱，導(dǎo)致極性較強(qiáng)的花色苷含量減少，這與任順成等[17]的研究結(jié)果一致。因此，確定70%為提取玫瑰茄花色苷的最佳提取體積分?jǐn)?shù)，在后續(xù)的試驗(yàn)中均采用這一體積分?jǐn)?shù)。

圖2 玫瑰茄花色苷紫外-可見光譜圖

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

2.4.2 料液比對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

由圖4可見，隨著料液比的變化，70%乙醇在55℃下以不同的料液比浸提玫瑰茄超微粉100 min后所得到的玫瑰茄總花色苷含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到峰值725.16 mg/100 g。曾哲靈等[18]在其研究中指出，當(dāng)料液比為1∶20～1∶25（g/mL）時(shí)，玫瑰茄花色苷含量最大，這與此次試驗(yàn)研究結(jié)果相靠近；當(dāng)料液比過(guò)小時(shí)，浸提溶液過(guò)少，導(dǎo)致玫瑰茄中的花色苷無(wú)法被充分浸提；當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，浸提溶液體積過(guò)多，玫瑰茄花色苷分子間作用力減小，穩(wěn)定性下降而分解，含量減小。

2.4.3 溫度對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間100 min的條件下，分別測(cè)定用不同溫度提取出的玫瑰茄超微粉總花色苷的含量，結(jié)果見圖5。提取溫度的升高促進(jìn)玫瑰茄花色苷的釋放，提取出的玫瑰茄總花色苷含量也不斷增加，并在55 ℃時(shí)達(dá)到最高值（724.97 mg/100 g）。之后由于溫度過(guò)高，花色苷的結(jié)構(gòu)受破壞而發(fā)生降解，含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖4 料液比對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

圖5 溫度對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

2.4.4 時(shí)間對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL）、浸提溫度55 ℃的條件下，分別測(cè)定不同提取時(shí)間下玫瑰茄超微粉總花色苷含量，結(jié)果見圖6。隨著浸提時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，玫瑰茄花色苷含量先增大后減小，在100 min時(shí)花色苷釋放量達(dá)到最大值。但長(zhǎng)時(shí)間的浸提導(dǎo)致花色苷發(fā)生降解，總花色苷含量減小。

圖6 時(shí)間對(duì)提取玫瑰茄花色苷效果的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)值分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken Design試驗(yàn)，以70%乙醇溶液，對(duì)自變量料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間組成的三因素三水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行花色苷含量的測(cè)定，結(jié)果見表3。

以一次浸提液中的玫瑰茄花色苷含量為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷含量影響的回歸模型方程：

Y=729.41+10.33A-3.03B+0.42C+1.88AB-0.42AC-0.83BC-33.33A2-14.13B2-14.76C2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表4。響應(yīng)面試驗(yàn)的回歸模型p=0.002 8＜0.01，模型達(dá)到高度顯著的水平。該模型的回歸系數(shù)R2=0.930 0，表明93%的數(shù)據(jù)均可以用此回歸模型方程解釋。失擬相p=0.756 9＞0.05，表明該回歸模型失擬不顯著，擬合程度良好。試驗(yàn)因素對(duì)70%乙醇溶液提取玫瑰茄超微粉中花色苷的影響順序?yàn)锳（料液比）＞B（浸提溫度）＞C（浸提時(shí)間）；回歸模型中A2對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響高度顯著（p＜0.01），A、B2、C2影響顯著（p＜0.05），AB、AC、BC影響不顯著（p＞0.05），表明3個(gè)因素之間的交互作用不明顯且對(duì)玫瑰茄花色苷含量的影響存在曲面效應(yīng)。

2.5.2 各因素交互作用對(duì)總花色苷含量的影響

利用Design Expert 8.0軟件擬合得到響應(yīng)曲面及等高線圖，如圖7～圖9所示。料液比和浸提溫度、料液比和浸提時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷含量影響的響應(yīng)曲面陡峭程度不明顯，浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷含量影響的響應(yīng)曲面平緩，所投射的等高線圖也均趨于圓形，表明料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間3個(gè)因素之間的交互作用均不顯著；當(dāng)浸提溫度較小、浸提時(shí)間較短時(shí)，料液比對(duì)響應(yīng)值的影響較大，在料液比1∶21（g/mL）后，隨著料液比的增加，曲面彎曲程度減緩，花色苷含量趨于穩(wěn)定；浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)提取玫瑰茄超微粉中的花色苷影響不如料液比，與方差分析結(jié)果一致，證明試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃浴?/p>

圖7 料液比和浸提溫度對(duì)玫瑰茄花色苷含量影響的響應(yīng)曲面

圖8 料液比和浸提時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷含量影響的響應(yīng)曲面

圖9 溫度和時(shí)間對(duì)玫瑰茄花色苷含量影響的響應(yīng)曲面

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化與驗(yàn)證

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行優(yōu)化，得到玫瑰茄超微粉中花色苷的最佳提取工藝條件：料液比1∶20.76（g/mL）、浸提溫度54.03 ℃、浸提時(shí)間100.28 min。此時(shí)，花色苷含量預(yù)測(cè)值為730.34 mg/100 g。為了便于驗(yàn)證試驗(yàn)的進(jìn)行，將最優(yōu)提取工藝條件調(diào)整為料液比1∶21（g/mL）、浸提溫度54 ℃、浸提時(shí)間101 min。在該工藝條件下平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得玫瑰茄花色苷含量為729.68 mg/100 g，與理論值基本吻合，表明模型的可靠度較高。

3 結(jié)論

超微粉碎后的玫瑰茄花萼超微粉粒徑減小到25 μm以下，相比于普通粉碎后的玫瑰茄粉，其顆粒大小分布均勻，成色更亮，花萼細(xì)胞破壁率增加，溶解性增大，同等條件下花色苷釋放量增大。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面BBD試驗(yàn)優(yōu)化玫瑰茄花色苷的提取工藝，通過(guò)試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷弥?，影響玫瑰茄花色苷含量的主要因素是料液比，次要因素是浸提溫度和浸提時(shí)間。驗(yàn)證后的玫瑰茄花色苷最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶21（g/mL）、浸提溫度54 ℃、浸提時(shí)間101 min，玫瑰茄花色苷含量為729.68 mg/100 g，比普通采用玫瑰茄花萼為原料提取所得的總花色苷含量要高得多[19-20]。進(jìn)一步表明超微粉碎對(duì)花色苷的釋放具有促進(jìn)作用，且結(jié)合響應(yīng)面分析法，能夠很好地優(yōu)化玫瑰茄花色苷的提取工藝，為玫瑰茄花萼超微粉的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。