超聲波酶法輔助提取人參皂苷工藝優化

李飛，穆娜，曲玉涵，冉旭東，王依，唐文翔

吉林化工學院生物與食品工程學院（吉林 132022）

人參（Panax ginsengC.A Mey）為五加科多年宿生草本植物，是傳統的名貴中藥材，在亞洲已有上千年的藥用歷史，其中的最為重要的有效成分為人參總皂苷，具有抗腫瘤、調節血糖、抗炎、抗氧化等作用，對人體神經系統、心血管系統、內分泌系統、免疫系統等具有廣泛的生物活性，并已經廣泛應用于臨床實踐[1-4]。2012年衛生部批準5年以下人參（人工種植）為新資源食品，可以作為產品原料添加到普通食品當中，這是對人參應于食品中給予科學的支持與肯定[5]。

傳統的人參皂苷提取方法有回流法，煎煮法、浸漬法等[6]。近年來，新的提取方法不斷的應用于人參皂苷提取的研究中。試驗使用超聲輔助酶法提取人參皂苷的工藝進行研究，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析對超聲輔助酶法提取工藝條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

人參（市售，吉林省集安地區人工種植5年參）；人參皂苷標準品（成都曼斯特生物有限公司）；無水乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸、正丁醇均為分析純；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；超聲儀（北京祥鵠科技發展有限公司）；紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 人參皂苷提取工藝流程

人參→干燥→粉碎→過80目篩→準確稱取4.0 g人參粉末→添加一定比例緩沖液中→酶解→滅酶（80℃，10 min）→超聲處理→離心（4 000 r/min，10 min）→得上清液→取5 mL使用水飽和正丁醇3次萃取→減壓蒸干→甲醇溶解

1.2.2 人參皂苷含量測定

標準曲線繪制：準確量取人參皂苷Re對照品溶液0，10，20，30，40和60 mg，將它們分別放入10 mL的具塞試管中，60 ℃的恒溫水浴鍋中蒸干，置于冰水中；分別加入0.5 mL 8%的香草醛-乙醇溶液和5 mL 72%的濃硫酸，旋渦混合器充分混合均勻，60 ℃水浴鍋中反應10 min后，冰水浴10 min；于544 nm下測定其吸光度，人參總皂苷含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣品測定：取1.2.1中用甲醇溶解后的溶液25 μL于試管中，水浴蒸干，加入8%的香草醛溶液0.5 mL 72%的硫酸溶液5 mL，旋渦混合器使其充分混勻后，置于60 ℃的恒溫水浴中反應10 min，立即取出，置于冰水混合物中，冷卻10 min，544 nm下測定吸光度。

1.2.3 單因素試驗

分別以纖維素酶添加量（0.05%，0.10%，0.15%，0.20%和0.25%）、果膠酶添加量（0.10%，0.15%，0.2%，0.25%，0.30%和0.35%）、料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL））、酶解溫度（30，35，40，45和50 ℃）、酶解時間（30，60，90，120和150 min）、酶解pH（4，5，6，7和8）、超聲時間（5，10，15，20，25，30，35和40 min）、超聲功率（200，300，400，500，600和700 W）為影響因素，研究不同水平下各因素對人參總皂苷提取率的影響。

1.2.4 Box-Behnken試驗設計

以單因素試驗得到的結果為基礎，以料液比、酶解時間以及超聲時間為響應因子，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗。依據回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以人參皂苷含量為響應值，分析優化的最佳提取條件。試驗的各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.2.5 數據分析

所有試驗均重復3次，數據均以平均值±SD表示，利用SPSS 17.0方差分析對組間和組內差異進行比較，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按照1.2.2中所述方法，以人參皂苷Re含量作為總人參皂苷含量的參考，繪制標準曲線得圖1。

圖1 人參皂苷標準曲線

2.2 單因素試驗結果

分別測定在不同纖維素酶添加量、果膠酶添加量、料液比、酶解溫度、酶解時間、酶解pH超聲時間、超聲功率條件下，各單因素對人參總皂苷的影響，繪制圖2。

人參皂苷的含量在纖維素酶添加量為0.20%之前隨著酶添加量的增加，提取率也在隨之逐漸增加，在添加酶量為0.20%時達到峰值，即為纖維素酶的最適添加量。人參皂苷的含量在果膠酶添加量為0.05%～0.25%之間逐漸增加，在添加酶量為0.25%時達到峰值，從曲線的結果來看，在果膠酶添加量為0.20%和0.25%時差別不是很大，因此選取與纖維素酶相同的添加量，即果膠酶添加量也為0.20%。隨著料液比的增加，皂苷提取率逐漸減小，由于緩沖液體積的增大，稀釋了人參粉末溶液的濃度，選取的料液比為1∶20（g/mL）。人參皂苷的最大提取量在酶解溫度為45 ℃時得到，隨著溫度的再次升高，皂苷得率在減小，因此選用45 ℃最為適宜。酶解時間在30～60 min之間的人參皂苷含量呈遞減趨勢，隨著酶解時間的增加酶解能力逐漸加強，在酶解時間為60 min時，人參總皂苷的含量顯示出峰值，說明在此時間下人參總皂苷的提取率較大，含量較多，因此應選擇60 min作為其最優酶解時間。在酶解pH 4～5的范圍內人參總皂苷的含量逐漸增加，到pH為5時達到峰值，應選擇pH為5作為其最優酶解pH。超聲時間為5～30 min時含量逐漸增大，但是在超聲時間超過30 min又之后逐漸下降，因此選擇30 min作為超聲時間最宜。人參皂苷含量在超聲功率為200～500 W時逐漸增大，在功率為500 W時皂苷提取量達到峰值，之后功率增大皂苷含量逐漸降低，為得到最大皂苷得率，選擇500 W作為最優超聲功率。

圖2 超聲輔助酶法提取單因素試驗結果

2.3 響應面優化試驗結果

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗結果的基礎上，選取料液比、酶解時間、超聲時間3個因素，采用三因素三水平響應面分析法進行試驗設計，結果見表2。將所得的試驗數據采用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得到以人參總皂苷含量為目標函數的二次回歸方程：

Y=-1.559 2×10-4A2-5.045 56×10-6B2+9.188×10-5C2+2.5×10-6AB+4.76×10-6AC+3.946 67×10-6BC+7.047 6×10-3A+3.976 83×10-4B-6.204 3×10-3C+ 0.045 888

表2 設計方案與結果

由表3可以看出，模型的決定系數R2=0.943 2，修訂系數R2adj=0.870 2，變異系數CV=4.43%，這些數值都說明，此多項式模型的有效性和準確性都是合乎常理、合乎要求的。

表3 回歸方程各項的方差分析

通過響應面軟件分析可知，料液比為1∶23.42（g/mL），酶解時間為54.98 min，考慮到實際操作的便利，將最佳提取工藝條件進行修正，料液比為1∶23.4（g/mL），酶解時間為55 min，超聲時間為25 min時人參皂苷的含量有最大值，人參皂苷含量為0.045 8（g/g），提取率為4.58%。

2.4 驗證試驗結果

為驗證響應面模型分析的正確性，按照給出的最佳提取條件進行試驗提取人參總皂苷，同時為避免試驗誤差，試驗平行3次進行。得到的人參總皂苷含量平均含量為0.046 3（g/g），提取率為4.63%實際值與預測值差異不顯著。所以可以認得到的工藝優化條件基本準確可靠，可以對人參皂苷提取進行很好的模擬和預測。

3 結論與討論

研究在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，通過響應面分析法對超聲輔助酶法提取人參總皂苷工藝進行優化，并得到回歸方程。經回歸分析并結合實際操作便利性，確定人參總皂苷提取的最佳工藝條件為纖維素酶、果膠酶添加量為0.20%，料液比為1∶23.4（g/mL），酶解溫度為45 ℃，酶解時間為55 min，酶解pH為5，超聲時間為25 min，超聲功率為500 W，人參皂苷的提取率為4.63%，實際值與預測值差異不顯著，試驗結果良好，說明該模型可靠性較高，能很好地預測各因素與人參皂苷提取率之間的關系。方法與使用索氏提取提取率3.27%[8]相比，具有條件溫和、操作方便及提取率高等特點，超聲輔助酶法輔助提取人參皂苷的工藝建立，為人參資源的開發與利用提供了試驗依據，將對其發展起到積極促進作用。