黑枸杞花青素不同提取工藝及抗氧化活性

王超雪，陳瑞戰*，陸娟，田利，殷微，楊汝憑

長春師范大學化學學院（長春 130032）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr）為茄科枸杞屬多年生多棘刺灌木，在我國主要分布于青海、寧夏、新疆、甘肅等地[1]；其果實味甜多汁，營養豐富，被譽為荒漠中的“軟黃金”和“黑珍珠”，極具研究和開發價值[2]。黑枸杞果富含花青素和多糖等多類活性成分[3]，現代藥理學研究發現黑枸杞果具有抗氧化、抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理活性[4-7]。

花青素通常與一個或多個單糖通過糖苷鍵連接形成的花色苷，屬于酚類化合物中的類黃酮[8]，是廣泛存在于植物中的天然色素[9]。花青素主要分布在表皮細胞的液泡內，是花和果實中的主要色素，具有極強的抗氧化活性[10]，能夠清除各種自由基，保護維生素A不被氧化；能夠增強機體免疫活性，提高免疫能力，具有抗過敏、抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種功效[11-12]。肌體新陳代謝過程中會產生大量的自由基，正常情況下體內抗氧化劑對自由基的清除與自由基的產生處于動態平衡，但過量積累的自由基會造成機體組織及細胞損害，引發各種疾病。因此，增加抗氧化劑攝入量，清除自由基對預防和治療相關疾病極為重要，天然花青素作為一類高效的天然抗氧化劑，越來越受到研究者和消費者的青睞。

采用不同工藝提取黑枸杞花青素，并進行自由基清除活性比較研究，旨在建立一種高效的天然花青素提取工藝。結果表明，微波提取具有產率高、時間短、操作簡便等優點，適宜于天然花青素的提取。不同提取工藝得到的黑枸杞花青素都具有顯著的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑用于功能食品和藥品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

黑枸杞（市售，產自青海省）；花青素標準品（AR，Adamas Reagent Co. Ltd）；DPPH（上海麥克林生化有限公司）；VC（AR，上海藍季科技發展有限公司）；吩嗪硫酸甲酯（PMS）、還原型輔酶Ⅰ、硝基四氮唑藍（NBT）（AR，北京鼎國生物技術有限責任公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

SU8000電鏡（日本日立）；SL-2010N超聲裝置（南京順流儀器有限公司）；IKA T10 basic閃式提取裝置（廣州儀科實驗室技術有限公司）；MAS-I微波提取儀（上海新儀微波化學科技有限公司）；MH 2000科偉電子調溫電熱套；N-1100旋轉蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司）；UV-1601紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器公司）；Heraeus Multifuge X1R高速離心機（德國）；Spectra Max Plus 384酶標儀（Molecular Devices，美國）。

1.2 黑枸杞花青素的提取

1.2.1 微波提取

準確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在輻射時間5 min、功率500 W、溫度40 ℃條件下微波提取；提取液在3 500 r/min、10 ℃、離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到超聲提取花青素。

1.2.2 超聲提取

準確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在提取溫度30 ℃、超聲功率210 W、超聲時間30 min條件下進行超聲提取；提取液在3 500 r/min、10 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到超聲提取花青素。

1.2.3 閃式提取

準確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，分別加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在設定條件下進行閃式提取：時間20 min、轉速8 000 r/min、溫度40 ℃；提取液在3 500 r/min、10 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到閃式提取花青素。

1.2.4 回流法提取

準確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，分別加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在設定條件下進行回流提取：提取時間2 h，提取溫度100 ℃。不同工藝的提取液在3 500 r/min、10 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到回流提取花青素。

1.3 花青素提取得率的測定

準確稱取0.004 g花青素標準品，用50%酸化乙醇（pH 3）定容至10 mL；精確移取0，2，4，6，8和10 mL溶液，用50%酸化乙醇（pH 3）定容至10 mL，靜止10 min，分別移1 mL于比色皿中，在波長530 nm下測定吸光度，以花青素濃度對吸光度進行回歸，繪制出花青素濃度與吸光度的標準曲線。花青素提取得率如式（1）。

式中：D為花青素提取得率，%；V為試樣定容體積，mL；n為稀釋倍數，m為試樣質量，g。

1.4 抗氧化活性試驗

1.4.1 有機自由基（DPPH·）清除活性測定

取50 μL不同濃度樣品溶液置于96微孔板中，分別加入20 μL DPPH溶液（0.4 mmol/L），混勻后避光放置30 min，在517 nm波長下測量吸光度。按照式（2）計算DPPH·清除活性。

式中：A0為空白對照試驗（水代替花青素溶液）的吸光度；A1為試驗樣品的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH·溶液的吸光度。

1.4.2 羥自由基（·OH）清除活性測定

取50 μL不同濃度樣品溶液置于96微孔板中，分別加入0.1 mL新配制FeSO4溶液（1.5 mmol/L）和0.07 mL H2O2（6 mmol/L），分別加入0.03 mL水楊酸溶液（20 mmol/L）。混勻后置于37 ℃水浴中恒溫1 h，在562 nm波長下測量吸光度。按照式（3）計算對·OH清除率。

式中：A0為空白對照試驗（水代替花青素溶液）的吸光度；A1為試驗樣品的吸光度；A2為為不加入水楊酸溶液的吸光度。

1.4.3 超氧自由基（·O2-）清除能力測定

取50 μL不同濃度樣品溶液置于96微孔板中，分別加入0.05 mL NBT溶液（0.15 mmol/L），分別加入0.05 mL還原型輔酶I溶液（0.47 mmol/L）和0.05 mL PMS溶液（0.06 mmol/L）。混勻后置于25 ℃水浴中恒溫5 min，在510 nm波長下測量吸光度。按照式（4）計算對·O2-清除率。

式中：A0為空白對照試驗（水代替花青素溶液）的吸光度；A1為試驗樣品的吸光度；A2為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）代替NBT溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 不同提取工藝對黑枸杞花青素提取得率的影響

微波提取時間5 min，提取功率500 W，溫度40℃，黑枸杞花青素提取率為5.1%；超聲提取溫度30℃、超聲功率210 W，超聲時間30 min，提取得率為4.7%；閃式提取時間20 min，轉速8 000 r/min，溫度40 ℃，提取率為3.5%；回流法提取時間2 h，溫度100℃，提取得率為3.2%；4種提取工藝對應提取得率如圖1所示。結果表明，不同提取工藝花青素的提取得率不同，微波提取法的提取得率最高，且時間短，操作簡便，是一種有效的花青素提取方法。超聲提取法花青素的提取得率也相對較高，分析可能的原因是在超聲波的空化、剪切等作用，強化花青素提取效率。熱回流提取花青素得率最低，可能是由于溫度過高，回流時間過長，破壞花青素結構，最終導致提取得率下降。

圖1 不同提取方法對花青素提取得率的影響

2.2 對DPPH·清除活性

自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也會隨之變小[13-14]。不同提取工藝的樣品對DPPH·清除能力如圖2所示。結果表明，4種提取方法得到的花青素都具有顯著的DPPH·清除活性，且清除活性與濃度成正相關關系。其中，在0.05～0.25 mg/mL試驗質量濃度范圍內，超聲提取產物的DPPH·清除活性最高，清除活性隨濃度增加而快速增加；在0.05～0.25 mg/mL試驗質量濃度范圍內隨濃度增加，4種方法得到的產物其DPPH·清除活性隨濃度增加緩慢增加，閃提產物的DPPH·清除活性相對較高，但微波、超聲和閃提產物的清除活性沒有明顯的差別；4種提取方法中的回流提取產物的DPPH·清除活性最低，分析可能的原因是常規的回流提取，溫度較高、回流時間較長，花青素可能發生結構變化，故其DPPH·清除活性相對較低。說明不同提取方法不僅能夠影響花青素的提取得率，而且能夠影響產物的DPPH·清除活性。

圖2 不同提取方法產物的DPPH·清除活性

2.3 對·OH清除活性

·OH是一種活性基因，幾乎可以與所有的生物分子、有機物或無機物發生各種不同類型的化學反應，并伴有非常高的反應速率常數和負電荷的親電性[15]。·OH是造成DNA、蛋白質、脂膜等生物大分子氧化損傷的主要原因，是公認的毒性最大的自由基[16-17]。不同提取方法的黑枸杞花青素對·OH清除能力如圖3所示。結果表明，4種提取方法得到的花青素都具有一定的·OH清除活性，且清除活性與濃度成劑量依賴關系。質量濃度為0.5 mg/mL時，微波、超聲、閃提和回流提取產物的·OH清除率分別為98.4%，97.4%，90.8%和36.2%，說明微波、超聲和閃提產物都具有較高的·OH清除活性，其中微波提取產物的·OH清除活性相對較高一些，但與超聲、閃提產物的清除活性差別不大。

圖3 不同提取方法產物的·OH清除活性

2.4 對·O2-自由基清除活性

圖4 不同提取方法產物的·O2-清除活性

·O2-作為生物體所產生的一種自由基，大量研究證明，自由基的作用與生物衰老、某些疾病的發病機制密切相關[18]。具有高的反應活性，在化學、醫學、生物、食品等領域受到廣泛關注。·O2-自身不太活潑，通過歧化反應及其它反應產生羥自由基和H2O2，是產生生物體中自由基的根源，所以清除·O2-具有很大意義。不同提取工藝的黑枸杞花青素對O2-自由基清除能力如圖4所示。在0.1～0.5 mg/mL質量濃度范圍內，微波、超聲和閃提提取產物對·O2-清除率隨濃度的增加快速增加；在質量濃度為0.5 mg/mL時微波、超聲和閃提產物對·O2-清除率分別為：98.5%，98.2%和92.8%，回流提取產物的×O2-清除率僅22.5%。進一步說明在較高溫度下和較長的回流時間作用下，花青素結構變化明顯，其·O2-清除能力大幅降低，說明黑枸杞花青素的提取適宜于較低的溫度下進行；在質量濃度超過0.5 mg/mL后微波、超聲和閃提產物對·O-2清除趨于完全，故隨濃度的增加其清除率變化不大。

2.5 不同提取工藝對植物組織的影響

圖5 不同提取工藝作用后樣品的掃描電鏡圖

為了進一步探討不同提取工藝的提取機理，通過掃描電鏡觀察不同工藝提取后的植物組織；組織破碎越徹底，單位質量的固體樣品的比表面積越大，與溶劑接觸的也越充分，花青素的溶解度和擴散的傳質的動力越大，提取得率就會越高[19]。通過掃描電鏡圖5可以看到，不同提取工藝對組織細胞的破壞程度不相同，因而提取得率也明顯不同。圖5（a）是微波提取后黑枸杞果組織細胞掃描電鏡圖，微波提取過程微波能快速傳遞到組織細胞內部，內部的極性分子在微波電磁場中快速轉向及定向排列，從而產生撕裂和相互摩擦，使胞內溫度迅速升高，使組織細胞內部壓力超過細胞空間膨脹的能力，導致細胞破裂，胞內花青素快速溶解、擴散到周圍溶劑中，提取過程加速、效率大幅提高，因而提取得率最高；圖5（b）是超聲提取后黑枸杞果組織細胞掃描電鏡圖，在超聲波空化、剪切等作用下，組織細胞有較大程度破碎，利于花青素的快速溶解、擴散，提取效率較傳統的回流提取有較大幅度的提高；圖5（c）是閃式提取后黑枸杞果組織掃描電鏡圖，在均質機的強剪切作用下細胞組織有所破碎，但組織破碎的程度有限，掃描電鏡圖可以發現大塊的細胞組織，其結果花青素由組織細胞內部向周圍提取溶劑的擴散阻力較超聲和微波提取都大，因此提取得率相對較低；圖5（d）是熱回流提取后組織細胞的掃描電鏡圖，回流提取是通過加熱使分子運動加速，使組織細胞有所破碎，胞內有效成分溶出，通過掃描電鏡圖可以發現，回流對組織細胞的影響相對較小，組織細胞的結構比較完整，因此提取得率也相對較低。結果說明不同提取工藝對細胞組織的破碎程度越徹底，強化傳質的效率越高，提取得率也越高。

3 結論

黑枸杞花青素提取工藝對比中，微波功率500 W、時間5 min、提取溫度40 ℃時花青素提取得率最高，方法時間短，提取率高，操作簡便，是一種高效的綠色提取技術。不同提取工藝其提取產物的抗氧化活性不同，其中微波、超聲和閃提產物都具有顯著的抗氧化活性，且活性與濃度具有劑量依賴關系，得到的花青素可以探索作為天然的抗氧化劑應用于功能食品和藥品。