基于整合藥理學(xué)探究中藥方劑治療勃起功能障礙核心藥物的作用機(jī)制*

孫占東 劉 嘉 曾明月 曾慶琪,3

1. 江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院（江蘇南京 211800）；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)（北京 100029）；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇南京 210029）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED），中醫(yī)稱之為陽痿，是臨床男科常見的性功能障礙疾病之一[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為陰莖不能勃起,或勃而不堅(jiān)，或堅(jiān)而不久,皆屬于該病的臨床表現(xiàn)[2]。中醫(yī)藥對(duì)其防治具有悠久的歷史，有著較為完整的理論架構(gòu)和特有的治療手段[3]。《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——中藥成方制劑》(簡稱《中藥成方制劑》)[4]中收錄不少于百種的中藥方劑，但目前的科學(xué)研究中，對(duì)于中藥治療勃起功能障礙的組方用藥規(guī)律，組方核心藥物的挖掘，藥物的成分、靶標(biāo)，分子內(nèi)在的作用機(jī)制等相關(guān)研究較少，未能較好的在微觀層面闡明中醫(yī)藥治療疾病的機(jī)理機(jī)制。

整合藥理學(xué)是中藥現(xiàn)代研究新模式,藥理學(xué)研究的新領(lǐng)域。由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所開發(fā)的“中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)v2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine v2.0,TCMIP V2.0）”，包含了中藥材、中藥方劑、中藥成分、中藥靶標(biāo)、 疾病相關(guān)分子等五大數(shù)據(jù)庫資源[5]，可用于揭示中醫(yī)藥理論的科學(xué)內(nèi)涵、挖掘組方用藥經(jīng)驗(yàn)、闡釋中藥作用原理、分析中藥藥理效應(yīng)等研究，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐和分析平臺(tái)。本研究基于TCMIPv2.0 平臺(tái)，分析中醫(yī)藥治療勃起功能障礙方劑的核心用藥，闡釋藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)（主要成分、靶點(diǎn)）及作用機(jī)制，為臨床及科研的深入開展提供一定的理論依據(jù)。

資料與方法

一、方劑收集錄入

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（http：//www.tcmip.cn/）中藥方劑數(shù)據(jù)庫中收錄了《中藥成方制劑》記載的方劑數(shù)據(jù)，包括方劑名稱、藥物組成、功效疾病、主治證候等信息。利用該平臺(tái)，按指定疾病“陽痿”提取數(shù)據(jù)庫中的方劑信息。

二、核心藥物數(shù)據(jù)挖掘

中藥治療勃起功能障礙的核心藥物由“高頻次單味藥材（藥物在所有方劑中出現(xiàn)次數(shù)大于20%）”與“高頻次藥組（藥組在所有方劑中出現(xiàn)次數(shù)大于20%）”的交集組成。通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)“組方用藥規(guī)律分析”模塊，對(duì)獲取到的方劑進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括處方中所含藥物頻次統(tǒng)計(jì)、組方規(guī)律。高頻次單味藥材的獲取，應(yīng)用“組方中藥的頻次統(tǒng)計(jì)”選項(xiàng)，可一鍵化獲得各味中藥的用藥頻次，選取用藥次數(shù)大于總方劑數(shù)×20%的藥物；高頻次藥組的獲取，應(yīng)用“組方中藥的關(guān)聯(lián)性分析”選項(xiàng)，該功能基于關(guān)聯(lián)規(guī)則算法，分別設(shè)置“2味、3 味、4 味”藥組，計(jì)算相應(yīng)藥組頻次，選擇頻率大于20%的藥組作為數(shù)據(jù)結(jié)果。

三、中藥化學(xué)成分來源

在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)-中藥材數(shù)據(jù)庫，對(duì)核心藥組藥物進(jìn)行檢索，收集所有化學(xué)成分，建立中藥治療“勃起功能障礙”核心藥組化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

四、中藥靶標(biāo)預(yù)測及GO 富集分析

利用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)中的“中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測及功能分析”模塊，依次輸入核心藥組藥物名稱，即可對(duì)核心藥組的藥物進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測及GO富集分析。該模塊針對(duì)中藥化學(xué)成分和FDA 上市藥物進(jìn)行相似性打分，獲取高可信度（Similar Score>0.8）的中藥候選靶標(biāo)譜，可進(jìn)一步闡釋中藥作用機(jī)理。

五、疾病相關(guān)基因集獲取

TCMIP V2.0 平臺(tái)整合了疾病 “基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫”（DisGeNET）、“人 類 表 型 本 體 數(shù) 據(jù) 庫”（HPO）、“Drugbank 數(shù)據(jù)庫”、“治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫”（TTD）等資源，構(gòu)建起疾病和常見臨床表型相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫。在TCMIP V2.0 平臺(tái)疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘模塊，以“erectile dysfunction”作為關(guān)鍵詞，通過檢索可獲取勃起功能障礙疾病的相關(guān)基因。

六、 中藥- 疾病核心靶標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及生物通路分析

通過整合藥理學(xué)平臺(tái)的“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊，該 模 塊 鑲 嵌 了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase 等包含蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，可構(gòu)建中藥與勃起功能障礙核心靶標(biāo)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network,PPI network)。應(yīng)用Cytoscape 3.4 軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)，該模塊整合了Reactome（https://reactome.org/）[6]生物通路數(shù)據(jù)庫，可對(duì)獲得網(wǎng)絡(luò)中包含的所有基因參與的生物通路進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、中藥治療勃起功能障礙核心藥物結(jié)果

應(yīng)用平臺(tái)中的中藥方劑數(shù)據(jù)庫，共計(jì)獲得治療勃起功能障礙方劑127 首，包含280 味中藥材。對(duì)各味中藥在方劑中出現(xiàn)的頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，提取頻率大于20%的藥材從高到低進(jìn)行列出。分別為枸杞子（72 首，57.6%）、菟絲子（62 首，49.6%）、熟地黃（61 首，48.8%）、淫羊藿（60首，48%）、肉蓯蓉（47 首，37.6%）、當(dāng)歸（43 首，34.4%）、人 參（42 首，33.6%）、山 藥（38 首，30.4%）、補(bǔ) 骨 脂（37首，29.6%）、茯苓（36 首，28.8%）、五味子（36 首，28.8%）、杜仲（35 首，28%）、巴戟天（34 首，27.2%）、黃芪（28 首，22.4%）、牛膝（26 首，20.8%）。藥物組合頻率大于20%的藥組，分析結(jié)果如表1 所示。綜合高頻次單味藥與高頻次藥組結(jié)果，確定中藥治療勃起功能障礙的核心藥物為枸杞子、熟地黃、肉蓯蓉、菟絲子、山藥、淫羊藿、杜仲、茯苓、當(dāng)歸、巴戟天、人參、補(bǔ)骨脂、五味子。

表1 治療勃起功能障礙方劑藥物組合頻率大于20%藥組

二、核心藥物化學(xué)成分

基于TCMIP V2.0中的中藥材數(shù)據(jù)庫，依次分析核心藥物的化學(xué)成分。枸杞子收集到化學(xué)成分57 個(gè)，主要為多糖、氨基酸、生物堿、揮發(fā)油等；熟地黃收集到化學(xué)成分12 個(gè)、主要為糖類、谷甾醇、核苷等；肉蓯蓉收集到50 個(gè)化合成分，主要為肉蓯蓉苷、生物堿、氨基酸等；菟絲子收集到化學(xué)成分8 個(gè)，主要為糖苷、胡蘿卜素、山奈酚等；山藥收集到45 個(gè)化合成分，主要為甘露糖、多巴胺、氨基酸等；淫羊藿收集到化學(xué)成分27 個(gè)，主要為黃酮類化合物、淫羊藿苷、棕櫚酸等；杜仲收集到化學(xué)成分52 個(gè)，主要為黃酮類、環(huán)烯醚萜、甾體和萜類等；茯苓收集到33 個(gè)化學(xué)成分，主要為多糖、脂肪酸、甾醇類等；當(dāng)歸收集到65 個(gè)化學(xué)成分，主要為揮發(fā)油、酚酸類、黃酮類等；巴戟天收集到19 個(gè)化學(xué)成分，主要為糖類、谷甾醇、胡蘿卜苷等；人參收集到158 個(gè)化學(xué)成分，主要為皂苷類、多糖類、有機(jī)酸等；補(bǔ)骨脂收集到32 個(gè)化學(xué)成分，主要為香豆素類、黃酮類、單萜酚類等；五味子收集到99 個(gè)化學(xué)成分，主要為木脂素類、有機(jī)酸、揮發(fā)性油等。

三、中藥靶標(biāo)預(yù)測及GO 富集分析結(jié)果

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，且已知作用靶點(diǎn)有限，通過獲得更多且可靠性高的靶標(biāo)是研究中藥作用原理的關(guān)鍵問題[7]。基于Tcmip V2.0 中的中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測及功能分析模塊可以獲得每味核心藥物的靶標(biāo)，并且對(duì)預(yù)測出的靶標(biāo)進(jìn)行GO 功能富集分析。枸杞子獲得靶標(biāo)基因235 個(gè)、熟地黃獲得靶標(biāo)基因656 個(gè)、肉蓯蓉獲得靶標(biāo)基因326 個(gè)、菟絲子獲得靶標(biāo)基因101 個(gè)、山藥獲得靶標(biāo)基因898 個(gè)、淫羊藿獲得靶標(biāo)基因200 個(gè)、杜仲獲得靶標(biāo)基因338 個(gè)、茯苓獲得靶標(biāo)基因232 個(gè)、當(dāng)歸獲得靶標(biāo)基因334 個(gè)、巴戟天獲得靶標(biāo)基因235 個(gè)、人參獲得靶標(biāo)基因1283 個(gè)、 補(bǔ)骨脂獲得靶標(biāo)基因255個(gè)、五味子獲得靶標(biāo)基因94 個(gè)。對(duì)各個(gè)藥物的靶標(biāo)基因取交集，13 位中藥共同作用的靶標(biāo)基因?yàn)锳R （雄激素受體） 基因。對(duì)核心藥物靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果如表2 所示。

表2 核心藥物靶點(diǎn)基因GO 富集分析結(jié)果

四、疾病相關(guān)基因集獲取結(jié)果

基于TCMIP V2.0平臺(tái)疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘模塊，輸入疾病關(guān)鍵詞后，共獲得勃起功能障礙疾病基因17 個(gè)，見表3。

表3 勃起功能障礙疾病相關(guān)基因

五、中藥-疾病蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及生物通路分析結(jié)果

應(yīng)用TCMIP V2.0平臺(tái)中的中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘模塊，可構(gòu)建中藥靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并可對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行深入的生物通路分析。基于平臺(tái)中的蛋白數(shù)據(jù)庫，核心藥物與勃起功能障礙疾病構(gòu)建的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中包含108 個(gè)基因，其中中藥基因101 個(gè)，疾病基因10 個(gè)，共同基因3 個(gè)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖1 所示。對(duì)核心靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物通路分析，顯著富集的前20 條通路結(jié)果如圖2 所示。

圖1 中藥與疾病核心靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 中藥與疾病核心靶標(biāo)生物通路富集分析結(jié)果（●為前20 條生物通路）

討 論

由于中醫(yī)藥治療勃起功能障礙的方劑較多，配伍較為靈活，靶點(diǎn)眾多，對(duì)其治療疾病的作用機(jī)制一直是科學(xué)研究的重、難點(diǎn)[8]。本研究采用挖掘組方規(guī)律與整合藥理學(xué)的方法，對(duì)《中藥成方制劑》中治療男科勃起功能障礙疾病的方劑進(jìn)行收集，挖掘方劑核心藥物的作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并進(jìn)行了深入的藥理學(xué)分析，為中藥方劑治療疾病的機(jī)理機(jī)制研究提供了新思路。

通過對(duì)《中藥成方制劑》中勃起功能障礙方劑的組方規(guī)律分析，從127 味中藥中挖掘出13 味核心藥物。其中居于前三位的單味藥為枸杞子、菟絲子、熟地黃；前三位藥對(duì)為枸杞子—菟絲子、枸杞子—熟地黃、熟地黃—菟絲子，與方劑“右歸丸”中部分藥物相吻合。“右歸丸”是治療陽痿遺精、腎陽不足的經(jīng)典名方[9]。結(jié)合該三味藥物的特性可知，中醫(yī)對(duì)于勃起功能障礙的治療首選溫補(bǔ)腎陽、益氣養(yǎng)血之品[10]。對(duì)13 味藥物進(jìn)行四氣五味歸經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)四氣中溫性藥占主體，有9 味藥屬溫性（肉蓯蓉、淫羊藿、杜仲、當(dāng)歸、巴戟天、熟地黃、人參、補(bǔ)骨脂、五味子），其余4 味皆屬平性（枸杞子、菟絲子、山藥、茯苓）；五味中甘味占多數(shù)，只有淫羊藿屬苦味、補(bǔ)骨脂屬辛味，其余藥材或?qū)偌兏饰叮驅(qū)俑省⒖啵省⑾蹋省⑿廖丁w經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，除當(dāng)歸屬心經(jīng)、肝經(jīng)、脾經(jīng)，其余12 味藥物皆含腎經(jīng)，并與肝經(jīng)、脾經(jīng)、肺經(jīng)、心經(jīng)、 大腸經(jīng)密切相關(guān)，說明藥物的作用以腎經(jīng)為根本，協(xié)同體內(nèi)其他臟器共同作用，產(chǎn)生滋腎壯陽、補(bǔ)血養(yǎng)陰、精氣充髓、活血通絡(luò)等功效，針對(duì)勃起功能障礙疾病表現(xiàn)出的腎虛肝郁、氣滯血瘀、濕熱下注、陰虛火旺等證，發(fā)揮特定的治療作用。

對(duì)于核心藥物化學(xué)成分的分析，再次證明了中藥具有多成分，且不同中藥具有相同成分的特性[11]。在用藥過程中，藥物的作用是復(fù)雜的多對(duì)多關(guān)系。以淫羊藿為例，該藥物以黃酮類化合物為主要成分，能夠影響下丘腦—垂體—性腺軸、腎上腺皮質(zhì)軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)，其提取液能已被證明能夠通過血睪屏障,在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮作用[12]。在當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、杜仲等中藥中也具有黃酮類成分。從而可知，核心藥物中所含的某些化學(xué)成分與勃起功能障礙疾病密切相關(guān)，為中醫(yī)臨床藥物的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。進(jìn)一步對(duì)藥物化學(xué)成分的作用靶標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每位中藥的靶標(biāo)數(shù)各不相同，但由于不同中藥之間具有相同的化學(xué)成分，以致不同藥物具有部分相同的靶標(biāo)，說明在基因作用層面，藥物仍存在協(xié)同作用的關(guān)系[13]，藥物的協(xié)同作用有效增強(qiáng)了藥效，對(duì)于疾病的治療起著積極促進(jìn)的作用。13 味核心藥物唯一共同作用的靶標(biāo)為AR（androgen receptor，雄激素受體）基因，該基因與體內(nèi)雄激素的形成密切相關(guān)，是雄激素作用的中介物質(zhì)，能夠使細(xì)胞的功能發(fā)生改變，具有促進(jìn)細(xì)胞分化和組織器官的發(fā)育等功能[14]。以此可推斷，13 味核心藥物對(duì)于勃起功能障礙疾病的治療，可能與調(diào)控體內(nèi)某些關(guān)鍵基因（如AR 基因）密切相關(guān)。通過對(duì)核心藥物全部靶點(diǎn)基因的GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)藥物主要參與氧化還原過程、藥物反應(yīng)脂質(zhì)代謝過程、類固醇代謝過程、 類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路等一系列生物過程，在線粒體、神經(jīng)元、髓鞘、突觸后膜等細(xì)胞位置，起到氧化還原酶的激活、藥物綁定、催化活性、核苷酸綁定、核受體的活動(dòng)等分子作用。

通過對(duì)中藥與疾病核心靶點(diǎn)蛋白相互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，可清晰的看出藥物作用靶標(biāo)與疾病作用靶點(diǎn)之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。在已知的藥物基因與勃起功能障礙基因之間，存在多對(duì)多的作用，既有共同相互作用的基因，也有獨(dú)立調(diào)控的基因。通過進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)功能分析，發(fā)現(xiàn)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)主要通過復(fù)合生物合成、protein kinase A（PKA）激活、腺苷酸環(huán)化酶激活途徑、Tumor Protein p53 （TP53)調(diào)節(jié)代謝、 胰高血糖素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中PKA 的激活、 胰高血糖素信號(hào)在代謝調(diào)節(jié)中的作用、Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2（VEGFR2）介導(dǎo)的血管通透等生物過程，在體內(nèi)產(chǎn)生治療勃起功能障礙疾病的作用。藥物與疾病的作用在微觀層面是復(fù)雜的，涉及多過程、多成分、多反應(yīng)，對(duì)于藥物治療勃起功能障礙的核心作用過程，仍需開展深入的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究利用整合藥理學(xué)方法從藥材—成分—靶標(biāo)—通路—疾病等不同層面，深入開展了中藥方劑治療勃起功能障礙方劑核心藥物的作用機(jī)制研究，較為清晰的闡明了中藥藥物在治療勃起功能障礙疾病過程中發(fā)揮的中藥作用。同時(shí)，本研究也為中藥方劑治療男科疾病的作用機(jī)制研究提供新思路與方法，進(jìn)而推進(jìn)中醫(yī)藥治療男科疾病的現(xiàn)代化。