不同源性精子經(jīng)ICSI-ET 助孕術(shù)后的臨床結(jié)局及子代安全性研究

賀 曉 李 博 孫 丹 黃劍磊

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心（陜西西安 710038）

自1992年卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)[1]問世以來，男性不育問題在臨床上得到了革命性的突破。對(duì)于嚴(yán)重少精癥、嚴(yán)重弱精癥及嚴(yán)重畸形精子癥患者，均可以通過ICSI 技術(shù)解決生育的問題； 而隨著顯微取精技術(shù)的發(fā)展，附睪穿刺取精及睪丸穿刺取精技術(shù)的發(fā)展解決了梗阻性無精癥患者或部分睪丸性無精癥患者的不育難題，在取得精子后也可以通過ICSI 技術(shù)獲得和自己有血緣關(guān)系的后代。但是附睪/睪丸穿刺取出的精子和射出精子經(jīng)過ICSI 技術(shù)后子代安全性方面的研究較少，樣本量一般也較小。故而本研究選擇了2017年1月至2019年5月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI-ET 助孕并行新鮮周期移植患者共1248 個(gè)周期為研究對(duì)象，比較分析附睪/睪丸來源的精子和射出精子在ICSI 技術(shù)助孕后臨床結(jié)局及子代安全性方面有無差異。

資料和方法

一、研究對(duì)象

采用回顧性隊(duì)列研究，選擇2017年1月至2019年5月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI-ET 助孕并行新鮮周期移植患者為研究對(duì)象，共1248 個(gè)周期。根據(jù)取卵當(dāng)日男方的取精方式分為兩組：手術(shù)取精組，即男方行附睪/ 睪丸穿刺取精組，共230個(gè)周期；對(duì)照組，即射出精子組，共1018 個(gè)周期。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）新鮮胚胎移植的ICSI-ET 周期，按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版標(biāo)準(zhǔn)[1]：精子濃度＜5×106/ml 或精子活動(dòng)率中前向運(yùn)動(dòng)PR≤5%或正常精子形態(tài)學(xué)≤1%；或連續(xù)2 次以上精液常規(guī)離心沉淀后未見精子，行診斷性附睪/睪丸穿刺可取到精子者；（2）女方年齡＜35 歲；（3）控制性超促排卵方案為黃體期長(zhǎng)方案或拮抗劑方案；（4）新鮮精子及卵子受精周期。

排除標(biāo)準(zhǔn)： 排除同時(shí)合并以下情況的治療周期：（1） 子宮內(nèi)膜異位癥患者；（2） 明確輸卵管積水患者；（3）復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者；（4）多發(fā)性子宮肌瘤患者、宮腔粘連、 子宮內(nèi)膜息肉及子宮畸形等子宮異常因素；（5）卵巢早衰患者；（6）補(bǔ)救性ICSI 治療周期；（7）遺傳學(xué)診斷/篩查（PGS/PGD）周期。

二、方法

1. 控制性超促排卵與ICSI-ET：ICSI-ET 治療方案按照本中心診療常規(guī)進(jìn)行。

黃體期長(zhǎng)方案于月經(jīng)周期第18-21 天開始予皮下注射醋酸曲譜瑞林注射液（達(dá)必佳，輝凌，瑞士，0.1 mg/支）0.05 mg～0.1 mg/ 天，連用12～14 天后開始卵巢刺激；拮抗劑方案于月經(jīng)周期第2～3 天開始卵巢刺激，根據(jù)血清雌二醇水平、LH 水平及卵泡直徑靈活添加拮抗劑 （思則凱，默克雪蘭諾，德國(guó)，0.25mg/ 支）0.125mg～0.375mg/天。基于患者年齡、體重、卵巢儲(chǔ)備情況選擇個(gè)體化卵巢刺激的啟動(dòng)劑量。主要選擇重組人促卵泡激素注射液（果納芬，默克雪蘭諾，德國(guó)）或者重組促卵泡素β 注射液（普麗康，默沙東，美國(guó)）100 U-300 U/ 天，必要時(shí)添加注射用尿促性素（樂寶得，珠海麗珠）或重組人促黃體激素（樂芮，默克雪蘭諾，德國(guó)）75～150U/ 天；當(dāng)卵泡直徑≥18mm 的卵泡數(shù)目≥3個(gè)時(shí)給予注射用絨促性素JY （麗珠，珠海）5000～10000U 或注射用重組人促性素（艾澤，默克雪蘭諾，德國(guó)）250ug 扳機(jī)，注射后36～38h 行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)。

取卵術(shù)后4-6h 脫顆粒及ICSI 注射，取卵術(shù)后72h后行胚胎移植術(shù)，移植胚胎數(shù)≤2 枚（單囊胚移植或雙卵裂期胚胎移植）。取卵手術(shù)當(dāng)日開始給予黃體酮注射液20mg/ 天，取卵后第2 天開始予陰道用黃體酮凝膠（雪諾同，默克雪蘭諾，德國(guó)）1 枚/ 天；胚胎移植術(shù)后繼續(xù)上述用藥行黃體支持。

2. 妊娠結(jié)局判定： 胚胎移植術(shù)后14 天查血HCG值，當(dāng)血HCG＞10 U/L 時(shí)為HCG 陽性；胚胎移植術(shù)后25 天～30 天首次超聲檢查確定有孕囊者診斷為臨床妊娠，同時(shí)確定孕囊的個(gè)數(shù)和位置。

3. 觀察指標(biāo)：包括一般情況參數(shù)、促排卵及實(shí)驗(yàn)室參數(shù)、ICSI-ET 的妊娠結(jié)局及圍產(chǎn)期結(jié)局。ICSI 受精率= （2PN 卵子數(shù)+1PN 卵子數(shù)+多PN 卵子數(shù)）/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；ICSI 正常受精率=D1 出現(xiàn)的2PN卵子數(shù)/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵子數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%； 多胎率=雙胎或多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕12 周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；胎兒畸形引產(chǎn)率=因胎兒畸形引產(chǎn)周期數(shù)/ 臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)的分娩數(shù)/ 移植周期數(shù)×100%；剖宮產(chǎn)率=剖宮產(chǎn)周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%；＜37 周早產(chǎn)率=＜37 活產(chǎn)周期數(shù)/活產(chǎn)總周期數(shù)×100%。

我中心優(yōu)質(zhì)胚胎的標(biāo)準(zhǔn)：在正常受精的前提下，D3胚胎細(xì)胞數(shù)7～9，碎片率＜20%，評(píng)分≥2 分；根據(jù)Gardner 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，3 期及3 期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分不含C 的囊胚。D3 可利用胚胎指受精后第3 天可移植和冷凍的胚胎總和；可利用囊胚指根據(jù)Gardner 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，3 期及3 期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分不同時(shí)含C 的囊胚。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用基于R 軟件的EmpowerStates （易侕統(tǒng)計(jì)軟件：www.empowerstats.com）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；分類變量以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)分析；采用多元回歸分析探討不同源性精子ICSI 后臨床結(jié)局及圍產(chǎn)期結(jié)局有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料比較

兩組患者的平均女方年齡、平均男方年齡、平均不孕年限及不孕因素構(gòu)成比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。手術(shù)取精組夫妻雙方年齡相比對(duì)照組年輕，不孕年限較短，同時(shí)合并女方不孕因素所占比例較低。

表1 兩組患者一般資料比較[(±s),n(%)]

表1 兩組患者一般資料比較[(±s),n(%)]

手術(shù)組(n=230) 對(duì)照組(n=1018) P女方年齡 27.78±2.94 28.94±3.05 ＜0.001男方年齡 29.68±4.49 31.24±4.76 ＜0.001不孕年限 3.51±2.26 4.07±2.61 ＜0.05不孕因素 ＜0.001單純男性因素 213(92.61) 713(70.04)合并女方因素 17(7.39) 305(29.96)

二、兩組患者促排卵實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

與對(duì)照組相比，手術(shù)取精組患者平均Gn 用量少，HCG日E2 水平較高，移植日內(nèi)膜厚度較厚，移植日內(nèi)膜形態(tài)相對(duì)好，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；手術(shù)取精組患者平均獲卵數(shù)及MⅡ卵數(shù)相對(duì)較多，但是ICSI 后的受精率及正常受精率相對(duì)低于對(duì)照組，P 均＜0.05；手術(shù)取精組的平均可利用胚胎數(shù)略高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。兩組患者HCG日P 水平、平均移植胚胎個(gè)數(shù)及卵裂期胚胎移植所占比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

三、兩組患者的妊娠結(jié)局及圍產(chǎn)期結(jié)局比較

手術(shù)取精組平均臨床妊娠率高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；但是兩組間的多胎率、早期流產(chǎn)率、胎兒畸形引產(chǎn)率、活產(chǎn)率、剖宮產(chǎn)率、＜37 周早產(chǎn)率及雙胎活產(chǎn)構(gòu)成比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），單胎活產(chǎn)或雙胎活產(chǎn)的子代出生孕周和出生體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組均無畸形兒出生。

表2 兩組患者的促排卵實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[(±s),n(%)]

表2 兩組患者的促排卵實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[(±s),n(%)]

注：E2 和P 法定單位分別為pmol/L 和nmol/L，換算公式分別是(pg/ml)×3.66 和(ng/ml)×3.17

手術(shù)組(n=230） 對(duì)照組(n=1018） p 值Gn 總量（支） 25.11±11.83 28.06±13.70 ＜0.05 Gn 總天數(shù) 10.83±1.83 11.07±2.01 ＞0.05 HCG日E2 值(pg/ml) 3603.94±1178.283276.30±1209.58 ＜0.001 HCG日P 值(ng/ml) 0.94±0.35 1.01±1.51 ＞0.05移植日內(nèi)膜厚度（cm） 1.07±0.15 1.05±0.14 ＜0.05移植日子宮內(nèi)膜形態(tài)百分比 ＜0.05 B 型 25(10.87) 65(6.39)B-C 型 196(85.22) 922(90.57)C 型 9(3.91) 31(3.04)移植胚胎胎齡百分比 ＞0.05卵裂期胚胎 225(97.83) 996(97.84)囊胚 5(2.17) 22(2.16)平均移植胚胎數(shù) 1.93±0.28 1.95±0.30 ＞0.05獲卵數(shù) 12.62±4.19 11.74±4.03 ＜0.05 MⅡ卵數(shù) 10.70±4.17 9.79±3.83 ＜0.001受精率 77.02 79.28 ＜0.05正常受精率 72.16 74.56 ＜0.05卵裂率 97.55 97.03 ＞0.05可利用胚胎數(shù) 5.53±3.12 5.07±2.95 ＜0.05優(yōu)良胚胎數(shù) 3.65±2.66 3.45±2.48 ＞0.05

表3 兩組患者的妊娠結(jié)局及圍產(chǎn)期結(jié)局比較[(±s),n(%)]

手術(shù)組(n=230) 對(duì)照組(n=1018) P臨床妊娠率 150/230(65.22) 589/1018(57.86) ＜0.05多胎率 65/150(43.33) 217/589(36.84) ＞0.05早期流產(chǎn)率 10/150(6.67) 53/589(9.00) ＞0.05胎兒畸形引產(chǎn)率 1/150(0.67) 1/589(0.17) ＞0.05活產(chǎn)率 129/230(56.09) 487/1018(47.84) ＞0.05剖宮產(chǎn)率 92/129(71.32) 370/487(76.76) ＞0.05＜37 周早產(chǎn)率 29/129(22.48) 90/487(18.48) ＞0.05單活胎 ＞0.05比例 83/129(64.34) 321/487(65.91) ＞0.05出生孕周(w) 38.84±1.26 38.81±1.68 ＞0.05出生體重(g) 3261.07±459.253303.60±503.70 ＞0.05雙活胎 ＞0.05比例 46/129(35.66) 166/487(34.09) ＞0.05出生孕周(w) 36.12±1.79 36.49±1.77 ＞0.05小孩1 出生體重(g) 2485.70±472.102575.91±417.33 ＞0.05小孩2 出生體重(g) 2402.72±347.282486.30±408.89 ＞0.05

四、多元回歸分析

鑒于上述基線資料不平，進(jìn)一步行多元回歸分析，在調(diào)整了夫妻雙方年齡、 不孕年限、 不孕因素、Gn 總量、HCG日E2、HCG日P、獲卵數(shù)、MⅡ卵子數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜形態(tài)等混雜因素后，提示手術(shù)取精組臨床妊娠率高于對(duì)照組（P＜0.05），兩組的子代出生體重和出生孕周并無差別。

表4 多元回歸分析[OR(95%CI)/β(95%CI)]

討 論

卵 胞 漿 內(nèi) 單 精 子 注 射（ICSI，intra-cytoplasmic sperm injection） 技術(shù)是指實(shí)驗(yàn)室胚胎學(xué)家利用顯微操作系統(tǒng)，根據(jù)精子形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，將經(jīng)過優(yōu)選后的單個(gè)精子直接注射到卵子細(xì)胞內(nèi)的被動(dòng)受精過程。相對(duì)于“一代試管嬰兒”技術(shù)，ICSI 技術(shù)是針對(duì)男性不育的治療手段。關(guān)于ICSI 技術(shù)的安全性問題，近些年來研究[2]認(rèn)為并沒有證據(jù)提示ICSI 技術(shù)本身引起胎兒畸形，與常規(guī)IVF 相比，ICSI 并不增加子代出生缺陷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。盡管如此，國(guó)內(nèi)邵小光學(xué)者[3]提出，ICSI 逃避了自然選擇可能帶來風(fēng)險(xiǎn)，建議應(yīng)嚴(yán)格限制非男性不育因素ICSI 在臨床的擴(kuò)大性應(yīng)用。

臨床上經(jīng)過連續(xù)2 次以上精液常規(guī)離心沉淀后未見精子稱為無精癥，占男性不育患者的10%～15%，根據(jù)輸精管道是否梗阻，分為梗阻性無精癥和非梗阻性無精癥[4,5]。隨著附睪/睪丸穿刺取精術(shù)及睪丸顯微取精術(shù)的發(fā)展[6,7]，梗阻性無精癥患者及部分非梗阻性無精癥患者可以通過手術(shù)取精后ICSI 助孕技術(shù)生育與自己有血緣關(guān)系的子代。

國(guó)內(nèi)研究[7-12]報(bào)道射出精子、睪丸精子及附睪精子做ICSI 后臨床妊娠率、 活產(chǎn)率及流產(chǎn)率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究回顧性分析1248 個(gè)鮮胚移植的ICSI 治療周期的一般指標(biāo)、促排卵實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、臨床結(jié)局及圍產(chǎn)期結(jié)局指標(biāo)，結(jié)果提示：手術(shù)取精組在獲卵數(shù)和MⅡ卵數(shù)更多的情況下，受精率和正常受精率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；手術(shù)取精組的活產(chǎn)率、流產(chǎn)率、＜37 周早產(chǎn)率及子代出生孕周和出生體重兩組均無差異； 兩組均無出生缺陷的發(fā)生。國(guó)內(nèi)研究[13]曾指出不同源性精子的成熟度可能主要影響ICSI 受精率，與本研究結(jié)論相一致，即手術(shù)取出的睪丸/ 附睪精子的ICSI 受精率顯著低于射出精子的ICSI 受精率。

同時(shí)，由于兩組患者年齡等基線資料不平衡，故通過多元回歸分析方法，在調(diào)整了兩組間不平衡基線資料后，提示附睪/睪丸精子經(jīng)ICSI-ET 術(shù)后臨床妊娠率高于射出精子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)本研究的數(shù)據(jù)提示手術(shù)取精組與對(duì)照組相比，流產(chǎn)率有降低趨勢(shì)，活產(chǎn)率有升高趨勢(shì)，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。關(guān)于這點(diǎn)目前研究結(jié)論尚存在一定的爭(zhēng)議。有很多學(xué)者的研究報(bào)道[7-12]認(rèn)為不同源性精子ICSI 后的臨床妊娠率、 流產(chǎn)率及活產(chǎn)率無差別。然而近些年來，越來越多的證據(jù)表明，用睪丸精子代替射精精子的ICSI（當(dāng)兩者都可用時(shí)）在某些特定情況下會(huì)增加妊娠結(jié)局[14-16]。有研究[14]提示非無精子癥男性的睪丸精子的DNA 碎片率比射出精子DNA 碎片率低2-3 倍。2017年Meta 分析[17]提示睪丸精子組經(jīng)ICSI 治療后的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于射出精子組，流產(chǎn)率顯著低于射出精子組。對(duì)于嚴(yán)重少弱精及隱匿性精子癥的男性患者，睪丸精子經(jīng)ICSI-ET 助孕后臨床結(jié)局更優(yōu)的原因可能在于睪丸精子的DNA碎片率明顯低于射出精子的DNA 碎片率[14]。

因本研究是回顧性分析，仍存在有不足之處。兩組間樣本量差距較大，可能影響臨床妊娠率的變量納入不全，可能對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果有一定的影響，以后尚需進(jìn)一步積累手術(shù)取精組的樣本量，擴(kuò)大樣本量及增加納入變量后進(jìn)一步驗(yàn)證。