對3個攜帶tRNALeu(CUN)12308A>G突變的Leber遺傳性視神經病變家系的檢測分析

王烜，梁敏，2，管敏鑫

（1.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

Leber遺傳性視神經病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種母系遺傳的視神經疾病，由Leber于1871年首次描述了此病的臨床癥狀而冠名。此病常發于男性青少年，為急性或亞急性，可雙眼同時發生或相繼發生，視力下降但不伴有轉眼痛并且呈現出視盤周圍神經纖維層腫脹和視網膜神經節細胞缺失等病變[1-2]。LHON與線粒體損傷存在著密切的關系，線粒體DNA突變是其主要致病分子基礎。自1988年Wallance等發現第一個與LHON相關的突變位點m.11778G＞A以來[3]，相繼報道過60多個與LHON相關的突變位點，其中線粒體復合體I上的ND1、ND4和ND6亞基是LHON有關突變熱點區域，但對位于tRNA上突變位點的報道相對較 少[4]。本研究報道了3個具有典型LHON臨床特征的中國漢族家系，經檢測不攜帶3個主要原發突變位點，但是攜帶tRNALeu(CUN)上的12308A＞G突變。m.12308A＞G突變可能會導致tRNALeu(CUN)的結構不穩定[5-6]，從而影響線粒體功能。本課題組對3個先證者家系中患者和攜帶者進行了臨床和分子遺傳學評估，并進行了線粒體基因全序分析，發現m.12308A＞G突變可能與LHON有關。

1 對象和方法

1.1 對象 本課題組與河北邢臺眼科醫院合作，建立了LHON家系收集網絡，在河北范圍內收集臨床上被診斷為LOHN的漢族患者295例，并收集了他們的外周血液和相應的臨床資料，同時收集了316例漢族正常人血樣作為對照。本研究通過溫州醫科大學倫理委員會批準，所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 眼科臨床檢查：對先證者和家系其他成員進行眼科臨床檢查，包括視力、視野、色覺、屈光度、眼壓、眼底、瞳孔對光反射、視覺誘發電位（visual evoked potential，VEP）等檢查。視力損害程度分級標準：正常≥0.3；一級視力損傷（輕度）0.1～0.3；二級視力損傷（中度）0.05～0.1；三級視力損傷（重度）0.02～0.05；四級視力損傷（極重度）光感～0.02；五級視力損傷為無光感[7]。

1.2.2 線粒體基因組突變分析：從3個家系先證者和其他母系成員的外周靜脈中抽取3～5 mL外周靜脈血，通過試劑盒（杭州易思得生物科技有限公司，DR0301050）提取血中DNA并用24對正反向線粒體引物進行DNA擴增。為了確定線粒體基因組的變異位點，用上述方法對3個家系的先證者進行線粒體全序擴增，通過DNAstar軟件包中的SeqMan對24對正反向測序結果進行拼接，導出拼接的測序結果為FASTA格式，再與修正的線粒體DNA劍橋標準序列（Cambridge reference sequence，rCRS，NC_012920.1）[8]進行比對，查找突變位點。

1.2.3 線粒體單倍體型分析：根據24對正反向引物擴增的PCR產物得出線粒體全序，對3個先證者的線粒體DNA進行單倍體型分析，并將其歸到不同的類型中[9]。

1.2.4 線粒體種系發生學分析：根據GenBank選取17種動物的線粒體序列，包括人（Homo sapiens）、大猩猩（Gorilla gorilla）、長臂猴（Hylobates lar）、鼠（Musmusculus）、斑馬魚（Danio rerio）、環尾狐猴（Lemur catta）、獼猴（Macaca mulatta）、 地中海獼猴（Macaca sylvanus）、白額卷尾猴（Cebus albifrens）、蜂猴（Nycticebus coucang）、倭黑猩猩（Pan paniscus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、阿 拉伯狒狒（Papio hamadryas）、蘇門答臘猩猩（Pongo abelii）、牛（Bos taurus）、紅毛猩猩（Pongo pygmaeus）、馬來跗猴（Tarsius bancanus）[10]，對線粒體上編碼tRNALeu(CUN)的基因序列進行保守性比對，并計算第44位點的保守系數。

1.2.5 線粒體拷貝數分析：采用Roche熒光定量試劑盒，對先證者和正常對照進行熒光定量PCR檢測。

1.3 統計學處理方法 采用Graphpad Prism 7軟件對先證者和正常對照者的線粒體數目的百分比進行繪圖和統計學分析。2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征 3個家系均來自邢臺，L23家系先證者為III-2，L157家系先證者為III-2，L362家系先證者為III-1。患者都是由于雙眼視力同時漸進性無痛性下降就診，且性別都為男性，發病年齡分別為13、14、11歲。對先證者進行了視力、眼底、屈光度等檢查，診斷為LHON，視力損傷程度分別為輕度、中度、輕度，并伴有視盤色淡充血等癥狀，先證者的臨床資料見表1，家系圖見圖1。對3個家系的外顯率進行了分析，分別為9.1%、28.5%、27.2%。

2.2 線粒體基因組分析 抽取靜脈血，提取DNA，通過PCR擴增目的片段，進行突變基因的分析，并與劍橋參考序列進行比對。本研究對先證者進行了3個主要原發位點的檢測，分別擴增了其ND1、ND4和ND63個基因片段，對其是否含有原發位點m.3460G＞A、 m.11778G＞A和m.14484T＞C進行了篩查，發現3個先證者均不含3個主要原發位點。隨后用24對正反向引物擴增了先證者和其母系成員的線粒體全序列并對突變位點進行了分析，發現3個先證者都攜帶位于D-loop上的73A＞G、263A＞G突變，16S rRNA上的1811A＞G、2706A＞G突變，ND2上的4769A＞G突變，COX1上的7028C＞T突變，ATP6上的8860A＞G突變和tRNALeu上的12308A＞G突變，3個家系母系成員突變位點集合見表2。選取的3個健康對照者（c1、c2和c3）與3個患者家系中的先證者線粒體序列見圖2。

表1 3例家系先證者的臨床資料

圖1 L23、L157和L362家系圖

通過對人、牛、鼠和猩猩等的mtDNA種系發生學進行分析，發現m.12308A＞G在3個先證者中高度保守，而316例正常對照中未發現12308A＞G突變位點。tRNA二級結構分析表明，12308A＞G突變位點位于tRNALeu(CUN)反密碼子莖和s環的交界處（通用位點44位，見圖3）。進一步對17個物種的種系發生學進行保守性分析發現，tRNALeu(CUN)的保守性系數為100%[11]，見圖4。

2.3 線粒體單倍體型分析 單倍體型是位于mtDNA某一區域的一組相關聯的SNPs位點。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護且長期處于高濃度的ROS環境下導致mtDNA較于核基因更易突變[12]。隨著這些變易位點的累積并以母系遺傳的方式傳遞給后代的過程中，逐漸形成了不同的單倍體型[13]。單倍體型以發現的先后對照字母的順序進行命名（由A到Z）[7，14]， 中國人群中主要存在A、B、C、D、F、G、M和Z等單倍體型[15]。本研究中的3個家系均屬于H2單倍體型。

圖3 tRNALeu(CUN)二級結構示意圖

2.4 線粒體拷貝數分析 為了探究m.12308A＞G突變是否影響了線粒體數量，我們選取了3個家系的先證者（mL23、mL157、mL362）進行線粒體拷貝數的測定，同時選取3個無血緣關系的正常人（c1、c2、c3）做對照，引物序列見表3，測定結果見圖5，對結果進行分析發現，mL23、mL157和mL362組線粒體拷貝數分別為對照組的79%、57%和91%，其中mL23和mL157組中患者線粒體拷貝數相對于正常對照者明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），說明突變位點tRNALeu(CUN)12308A＞G可能造成線粒體損傷，從而導致線粒體數量下降[16]。

3 討論

m.11778G＞A是LHON亞洲人群中最常見的原發突變位點，線粒體復合體I的ND1、ND4和ND6亞基上的堿基突變是引起LHON的熱點區域，但是編碼tRNA的區域也是十分重要的。在以往的報道中已經發現了tRNA上的某些位點會影響線粒體功能從而導致線粒體疾病，例如tRNAMet4435A＞G會提高高血壓的發病風險[17]，而tRNAThr15927G＞A會提高LHON的發病風險[18]。

本研究中3個家系都表現出典型的LHON發病特征，即發病者都為男性，發病年齡小，發病急，可雙眼同時發生或相繼發病。對先證者和其他母系成員線粒體全序進行基因分析，發現3個家系均攜帶tRNALeu(CUN)12308A＞G突變，而316例正常對照人群樣本中未發現此突變位點，我們推測tRNALeu(CUN)12308A＞G可能與LHON發病有一定關系。

圖4 17個物種突變位點保守性分析

表2 3個家系先證者突變位點集合

續表2

圖5 線粒體拷貝數相對百分比比較

表3 線粒體拷貝數測定引物序列

本研究中3個LHON家系的外顯率為9.1%、28.5%和27.2%，與已報道的m.14502T＞C和m.3394T＞C在漢族LHON患者中占比相近，但遠遠小于m.11778G＞A 突變的外顯率（10～90%）[19]。

在tRNA二級結構圖中，我們發現m.12308A＞G 突變在第44位上發生了堿基替換，17個物種的tRNALeu(CUN)序列在此位點高度保守。tRNALeu(CUN)第44位在tRNALeu(CUN)反密碼子莖最后一位與s段的交接位點處。tRNA的二級結構常為三葉草結構，在20世紀70年代初科學家們用X射線衍生技術分析發現tRNA的三級結構為倒L形。tRNA三級結構的特點是氨基酸臂與TψC構成L的橫，二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環共同構成L的豎，s段的作用是在tRNA的L型三級結構中負責連接這兩個區域（D環-反密碼子環和TψC-受體臂）[20-21]。在tRNA中第44位與第26位相互作用對tRNA三級結構的維持發揮一定作用[22]，推測此位點的改變可能影響tRNA三級結構的穩定性。

線粒體拷貝數是衡量線粒體數目的重要標志。我們選取了3個LHON家系的先證者進行線粒體拷貝數的測定，發現患者的線粒體數量相對于正常對照者明顯減少，提示tRNALeu(CUN)12308A＞G突變會造成線粒體數量減少，從而使細胞供能障礙。

在不同遺傳背景的LHON家系中，先證者均攜帶tRNALeu(CUN)12308A＞G突變且不攜帶3個發病率較高的LHON原發位點，說明tRNALeu(CUN)12308A＞G是LHON的潛在分子發病基礎，但在攜帶該突變的家系中發病率較低與患者患病程度較輕說明突變本身不足以造成LHON的表型表達，提示可能有其他修飾因子對這些家系發病起協同作用，包括環境因素、核基因[23]、表觀遺傳修飾[24]、線粒體單倍體型等[25]。