RSK2通過(guò)調(diào)控人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖與遷移促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)

汪佳男，朱忠欣，叢維濤

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

皮膚對(duì)機(jī)體發(fā)揮著重要的屏障作用，一方面皮膚可以使機(jī)體內(nèi)的組織器官免受諸如物理性、機(jī)械性損傷或病原微生物等侵害，另一方面調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)水、電解質(zhì)等物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。作為人體第一道防線，皮膚易受損傷（如燒傷、慢性疾病等），從而失去屏障效應(yīng)，誘發(fā)感染，嚴(yán)重時(shí)可致殘致死[1-3]。因此，加快皮膚的創(chuàng)面修復(fù)，無(wú)論是在傷口難愈的疾病還是在術(shù)后修復(fù)中均具有十分重要的臨床意義[4]。

RSK2，即p90核糖體蛋白s6激酶，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)。RSK2能夠應(yīng)答多種生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和環(huán)境壓力等[5]。RSK2調(diào)控的下游底物包括：ATF1、ATF4（CREB2）等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄[6]；Caspase-8、IκB等信號(hào)分子抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞活性[7]；組蛋白3、組蛋白2AX等表觀遺傳因子調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化[8-9]。RSK2目前在腫瘤領(lǐng)域中研究比較廣泛，腫瘤誘導(dǎo)藥物如佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）可激活RSK2，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤病變[10]。LUDWIK等[11]發(fā)現(xiàn)，RSK2的核內(nèi)聚集能夠促進(jìn)乳腺癌的腫瘤生成。盡管RSK2能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖與遷移，但其在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。基于上述研究背景，本研究探討RSK2對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001。小鼠體質(zhì)量約25 g，約8周齡，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，清潔飲水，自由取食。

1.1.2 主要試劑與耗材：一抗RSK2、Vimentin、Fibronectin、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）購(gòu)于美國(guó)CST公司；Cyclin D1、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 （plateletendothelial cell adhesion molecule，CD31）購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；GAPDH購(gòu)于合肥Biosharp公司。組織裂解液、BCA試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；ECL曝光液購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.1.3 主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）、-80 ℃超低溫冰箱（德國(guó)Eppendorf公司）、低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）、高通量組織研磨儀（上海萬(wàn)柏公司）、細(xì)胞超聲破碎儀（寧波新芝公司）、微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)GE公司）、激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、正置顯微鏡（日本Nikon公司）、倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 人原代真皮成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblast，HDF）的提取：選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院健康男性兒童的包皮組織，從中提取原代真皮成纖維細(xì)胞[12-13]。本研究征得患者及其家屬的知情同意并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將HDF接種于48孔板，培養(yǎng)24 h。用槍頭劃直線，創(chuàng)傷+Bix 02565組加入Bix 02565共同孵育2 h，創(chuàng)傷對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，分別于0、12、24 h后用倒置顯微鏡拍攝各組細(xì)胞的遷移狀況，以12 h或24 h劃痕后面積變化作為細(xì)胞遷移速率。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：將HDF接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，密度控制在每孔2×103個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁，用槍頭對(duì)創(chuàng)傷組別劃痕，加入Bix 02565，培養(yǎng)2 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2～3 h，酶標(biāo)儀下測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度。每組均設(shè)空白對(duì)照組，各組測(cè)得的吸光度減去空白組的吸光度作為最終吸光度值。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)：向經(jīng)劃痕造模的HDF中加入RSK2抑制劑Bix 02565（5 μmol/L）孵育2 h。HDF經(jīng)裂解超聲破碎后，于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液檢測(cè)蛋白濃度。將等量裂解蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，利用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立和分組：將24只雄性小鼠隨機(jī)分為創(chuàng)傷對(duì)照組和創(chuàng)傷+Bix 02565組（Bix 02565：1 mg/kg）。小鼠用5%水合氯醛0.8 mL/100 g 劑量腹腔注射麻醉，脫去背部毛發(fā)后消毒，兩側(cè)使用內(nèi)徑為8 mm硅膠環(huán)固定，沿內(nèi)徑剪去全層皮膚。創(chuàng)傷+Bix 02565組在創(chuàng)傷造模基礎(chǔ)上皮下注射RSK2抑制劑Bix 02565（1 mg/kg），每2天注射1次。創(chuàng)傷對(duì)照組于同一時(shí)間皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.6 創(chuàng)面修復(fù)速率檢測(cè)：術(shù)后第0、第3、第7、第14天，每天同一時(shí)間記錄創(chuàng)面修復(fù)狀況，計(jì)算創(chuàng)面修復(fù)率。

1.2.7 皮膚組織HE染色：取下小鼠創(chuàng)面全層皮膚組織，經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟與水化后，切片（5 μm） 置于蘇木精溶液1 min，流水沖洗1 min；置于伊紅染液30 s，流水沖洗1 min；脫水、二透明、封片，正置顯微鏡拍攝。

1.2.8 皮膚組織Masson染色：皮膚切片用Bouin液37 ℃固定2 h，流水沖洗至無(wú)黃色；天青石藍(lán)30 s， 稍水洗；蘇木素染色2～5 min，稍水洗；酸性乙醇分化液數(shù)秒，流水沖洗3 min；麗春紅品紅染色液染色5～10 min，稍水洗；磷鉬酸溶液洗10～15 min。 傾去液體，直接入苯胺藍(lán)3～5 min。0.2%弱醋酸工作液2 min。脫水、透明、封片。

1.2.9 免疫熒光染色：皮膚切片置于含0.3% Triton X-100的PBS中室溫通透20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。含5% BSA的PBS封閉60 min。1% BSA的PBS配置一抗，室溫孵育4 h。PBS漂洗3次，每次5 min。 1% BSA的PBS配置二抗，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI染細(xì)胞核10 min，PBS漂洗2次，每次5 min。滴加抗熒光淬滅劑，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)至少平行重復(fù)4次，計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚創(chuàng)傷對(duì)RSK2蛋白表達(dá)無(wú)影響 小鼠創(chuàng)傷造模后的第0（D0）、第3（D3）、第7（D7）天，利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)創(chuàng)面及周圍全層皮膚組織RSK2的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷后第3和第7天創(chuàng)面皮膚組織中RSK2的蛋白表達(dá)與第0天相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1A-B。免疫熒光染色并統(tǒng)計(jì)分析RSK2的熒光強(qiáng)度，與Western blot結(jié)果一致，創(chuàng)傷后第3和第7天創(chuàng)面皮膚組織中RSK2的熒光強(qiáng)度與第0天相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1C-D。

圖1 創(chuàng)面皮膚組織中RSK2的蛋白表達(dá)與免疫熒光強(qiáng)度變化

2.2 Bix 02565抑制劃痕誘導(dǎo)的HDF增殖與遷移 RSK2的抑制劑Bix 02565用于細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)，創(chuàng)傷+Bix 02565組的HDF在劃痕后12 h及24 h，其中央創(chuàng)傷面積占比顯著大于創(chuàng)傷對(duì)照組（P＜0.05）， 即Bix 02565抑制了HDF的遷移，見(jiàn)圖2A。同時(shí)，CCK-8法檢測(cè)HDF的增殖活性實(shí)驗(yàn)中，HDF經(jīng)劃痕刺激后的增殖活性顯著強(qiáng)于創(chuàng)傷對(duì)照組，在Bix 02565 給藥后增殖水平顯著回落（P＜0.01），而抑制劑本身并不影響細(xì)胞活性，見(jiàn)圖2B。

將HDF總蛋白樣品用于Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，HDF在劃痕刺激后Cyclin D1（G1/S-特異性周期蛋白-D1，指征增殖水平）及Fibronectin（纖維粘連蛋白，指征遷移水平）的蛋白水平均出現(xiàn)上調(diào)，而加入RSK2抑制劑Bix 02565可顯著抑制細(xì)胞劃痕誘導(dǎo)的Cyclin D1和Fibronectin的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），圖2C-D。

2.3 Bix 02565減緩小鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)速率 在小鼠皮膚創(chuàng)傷第0、第3、第7、第14天后，分別拍攝皮膚創(chuàng)面修復(fù)狀況，2組均有不同程度的愈合，而給予Bix 02565后第3、第7天創(chuàng)傷面積所占百分比均顯著大于創(chuàng)傷對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖3。同時(shí)，將第3、第7天創(chuàng)面處全層皮膚組織進(jìn)行HE染色和Masson染色。HE染色結(jié)果顯示，創(chuàng)傷+Bix 02565組傷口大小在第3、第7天均大于創(chuàng)傷對(duì)照組，見(jiàn)圖4A。Masson染色結(jié)果證實(shí)，創(chuàng)傷+Bix 02565組創(chuàng)面下方肉芽組織的膠原纖維（藍(lán)色）含量遠(yuǎn)低于創(chuàng)傷對(duì)照組，而膠原纖維是由肌成纖維細(xì)胞分泌，提示成纖維細(xì)胞的增殖及分化不足，見(jiàn)圖4B。

圖2 Bix 02565抑制細(xì)胞劃痕誘導(dǎo)的HDF增殖與遷移

圖3 Bix 02565減緩小鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)速率

2.4 Bix 02565抑制小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的增殖與血管新生 小鼠創(chuàng)傷造模的第3、第7天對(duì)皮膚組織進(jìn)行免疫熒光染色，分別檢測(cè)創(chuàng)面新生肉芽組織中PCNA與CD31。結(jié)果顯示2組PCNA熒光強(qiáng)度均隨創(chuàng)傷天數(shù)增加逐漸增強(qiáng)，而創(chuàng)傷+Bix 02565組熒光強(qiáng)度顯著弱于創(chuàng)傷對(duì)照組，且第7天差距最為顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖5A-B。檢測(cè)創(chuàng)傷后第7天創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)的新生血管數(shù)量，結(jié)果顯示創(chuàng)傷+Bix 02565組的新生血管內(nèi)徑顯著小于創(chuàng)傷對(duì)照組，且新生血管數(shù)量也少于創(chuàng)傷對(duì)照組，見(jiàn)圖5C。

3 討論

皮膚是機(jī)體最大的器官，在機(jī)體中扮演重要的角色。而皮膚是最容易受到外界損傷的器官，創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)精確復(fù)雜、分時(shí)相的動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及細(xì)胞增殖、遷移、胞外基質(zhì)降解、血管新生和上皮組織重塑等多種細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[14-15]。各時(shí)期的過(guò)渡轉(zhuǎn)化主要取決于所參與細(xì)胞的類型及新生細(xì)胞的成熟與分化，涉及的細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[16]。這些細(xì)胞通過(guò)增 殖、遷移、分化，與生長(zhǎng)因子等信號(hào)通路共同作用重建皮膚[3]。其中，細(xì)胞增殖與遷移能夠激發(fā)新的細(xì)胞外基質(zhì)生成并且促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[17]。在這一過(guò)程中，尤其是成纖維細(xì)胞的增殖與遷移對(duì)肉芽組織形成和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)尤為關(guān)鍵[18]，REINKE等[19]研究表明，成纖維細(xì)胞主要參與增殖期與組織重塑期。在增殖期，成纖維細(xì)胞大量增殖、遷移并形成肉芽組織，主要起到抵抗感染、添補(bǔ)創(chuàng)面等作用。同時(shí)，傷口周邊的角質(zhì)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)遷移至創(chuàng)傷處，形成新生表皮組織。到組織重塑階段，由成纖維細(xì)胞分化而來(lái)的肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì) 胞發(fā)生凋亡，最終真皮組織由細(xì)胞外基質(zhì)蛋白所填補(bǔ)[20]。在保證機(jī)體自身修復(fù)質(zhì)量的同時(shí)，使皮膚盡快恢復(fù)屏障功能一直是皮膚領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)所在。在之前的大量研究中，諸多激酶如Akt、STAT3、GSK-3α/β等都發(fā)揮著不可或缺的作用[21-23]。

圖4 小鼠創(chuàng)傷造模后第3、第7天創(chuàng)面皮膚切片組織HE染色和Masson染色結(jié)果

圖5 Bix 02565抑制小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的增殖與血管新生

RSK2作為20世紀(jì)末期發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶[24]，人們對(duì)于其功能的了解往往限于疾病的發(fā)生與發(fā)展中，而忽視其在維持機(jī)體平衡中的作用。本研究著重將RSK2與成纖維細(xì)胞和創(chuàng)面修復(fù)聯(lián)系在一起。在研究過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)皮膚創(chuàng)傷與RSK2的總蛋白表達(dá)并無(wú)直接聯(lián)系。然而，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RSK2活性抑制劑Bix 02565可抑制成纖維細(xì)胞的遷移。為了進(jìn)一步核實(shí)RSK2在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的作用，我們通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bix 02565顯著抑制了成纖維細(xì)胞的增殖水平，而其對(duì)正常細(xì)胞本身并無(wú)毒性作用。在Western blot實(shí)驗(yàn)中確證了增殖及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)亦被Bix 02565抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們建立C57BL/6小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，探究RSK2在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bix 02565顯著減緩了皮膚的創(chuàng)面修復(fù)速率，抑制創(chuàng)面處肉芽組織膠原纖維的生成。同時(shí)，通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Bix 02565抑制了增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)以及血管新生。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以推斷，盡管創(chuàng)傷并不影響RSK2本身的表達(dá)，但可能存在以下幾種可能性：①創(chuàng)傷條件下成纖維細(xì)胞中RSK2的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生修飾，在碳、氮末端激酶結(jié)構(gòu)域（CTKD、NTKD）與中央鉸鏈區(qū)（LD）均有可能出現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)。②創(chuàng)傷影響了RSK2與下游蛋白的結(jié)合能力從而調(diào)節(jié)下游信號(hào)。③創(chuàng)傷改變了RSK2的亞細(xì)胞定位，例如入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)。在創(chuàng)傷條件下，RSK2細(xì)胞內(nèi)的具體機(jī)制與信號(hào)通路仍需要在下一步實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探索。

RSK2是p90核糖體蛋白s6激酶，其功能的調(diào)控往往與細(xì)胞的增殖、遷移與分化有關(guān)，而這也奠定了其在整個(gè)機(jī)體調(diào)控中所扮演的角色。本研究著重發(fā)現(xiàn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)與RSK2的關(guān)系，闡明了RSK2對(duì)于皮膚成纖維細(xì)胞功能的調(diào)控作用，然而，創(chuàng)傷如何通過(guò)RSK2調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的活化以及去活化，以及RSK2如何調(diào)控皮膚成纖維細(xì)胞仍屬未知。已有研究報(bào)道RSK2能夠應(yīng)答生長(zhǎng)因子，例如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，bFGF誘導(dǎo)的FGFR3-RSK2信號(hào)激活可能通過(guò)促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖與遷移和破骨細(xì)胞的生成從而起到關(guān)鍵作用[25]。YOO等[26]和HAMAOKA等[27]發(fā)現(xiàn)EGF能夠通過(guò)RSK2激活ELK3（ELK家族）或EphA2 （Eph受體酪氨酸激酶成員）從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化。而已有文獻(xiàn)報(bào)道bFGF與EGF均能夠促進(jìn)皮膚的創(chuàng)面修復(fù)[28-29]，RSK2在創(chuàng)面修復(fù)中的作用是否與上述的信號(hào)存在相似的途徑尚不明確，仍需要進(jìn)一步探索。而我們有理由相信，隨著科學(xué)技術(shù)不斷的發(fā)展，理論研究的不斷前進(jìn)以及醫(yī)療水平的不斷提高，創(chuàng)面修復(fù)這一課題將會(huì)越來(lái)越完善，飽受創(chuàng)傷困擾的患者也將得到更好的醫(yī)治。