RP-HPLC法測定甘氨酸原料藥有關物質研究

趙士敏 許 崗 施細文 王 敏

（湖南福來格生物技術有限公司，湖南 長沙 410000）

甘氨酸（Glycine，縮寫Gly）又名氨基乙酸，甘氨酸是內源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，機體發生嚴重應激時常用外源補充，有時也稱為半必需氨基酸[1]。甘氨酸在食品、醫藥等領域應用廣泛[2]。在醫藥行業中可以用作氨基酸制劑、抗胃酸沖劑以及其他賦形劑[3]。甘氨酸的工業生產方法主要有3 種，天然蛋白質水解法、氯乙酸氨解法和Strecker 法。目前國內普遍采用氯乙酸氨解法，國外則以Strecker 法為主。甘氨酸的原料藥中可能會產生甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽等雜質，但是國內尚未有關于測定甘氨酸原料藥中這些雜質的報道。為了有效控制甘氨酸原料藥的質量，保證用藥安全，該實驗采用HPLC法同時測定甘氨酸原料藥中的上述5 種雜質，為原料藥的質量控制提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT 高效液相色譜儀；梅特勒320pH 酸度計；奧豪斯EX225DZH 十萬分之一天平；抽濾裝置、微孔濾膜（硝化纖維型，φ50 cm，孔徑0.22 μm）；上海一恒科學儀器有限公司[4]。

甘氨酸3 批：由湖南寶利士生物技術有限公司提供，甘氨酸酐（含量≥98%，標準物質），亞氨基二乙酸（含量≥98%，標準物質，），2-氯乙酸（含量≥98%，標準物質），雙甘肽（含量≥98%，標準物質），三甘氨肽（含量≥98%，標準物質），以上標準物均有Sigma 公司提供。庚烷磺酸鈉、磷酸（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司，超純水：由DZG-303A 艾科超純水機制得，乙腈（HPLC 級）：Merck 公司[5]。

1.2 溶液的配制

流動相溶液：稱取庚烷磺酸鈉2.24 g，加水975 mL 溶解后，用磷酸調節pH 值至2.2，過濾后，再加入25 mL 乙腈，超聲。

稀釋劑溶液：同流動相溶液。

對照品儲備溶液：稱取各組分雜質對照品約25 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度。（溶液濃度為500 μg/mL）。

各組分對照二級儲備液：精密量取各組分對照品貯備液0.5 mL，置10 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度。（溶液濃度為25 μg/mL）。

對照品溶液：稱取甘氨酸25 mg 和各組分對照品二級貯備液1.0 mL，置于同一50 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度。

各組分對照溶液：精密稱取雜質甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽對照品各約10 mg，分別至5 個50 mL 容量瓶中，加溶劑溶解后稀釋至刻度，搖勻，分別作為各組分的對照溶液。（溶液濃度為0.5 mg/mL）。

供試品溶液：稱取該品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度。

80%限度加標供試品溶液：精密稱取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各組分對照品二級貯備液0.8 mL，加稀釋劑稀釋至刻度，平行制備3 份。

100%限度加標供試品溶液：精密稱取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各組分對照品二級貯備液1.0 mL，加稀釋劑稀釋至刻度，平行制備3 份。

120%限度加標供試品溶液：精密稱取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各組分對照品二級貯備液1.2 mL，加稀釋劑稀釋至刻度，平行制備3 份。

1.3 分析方法

色譜柱CenturySIL C18-AQ（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相（含2.24 g/L 庚烷磺酸鈉，用磷酸調節pH 值至2.2）-乙腈（97.5 ∶2.5），檢測波長為200 nm，流速為1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫25 ℃。

2 結果

2.1 系統適用性與儀器精密度

將對照品溶液連續進樣6 針，考察各峰間的分離度、理論塔板數、拖尾因子、各峰保留時間的RSD、各峰峰面積的RSD。結果表明，在該條件下各峰間的分離度≥1.5，理論塔板數≥2 000，拖尾因子≤2.0。各峰保留時間RSD ≤1%，主峰面積RSD ≤2%，雜質峰面積RSD ≤10%。結果見表1，色譜圖如圖1 所示。

表1 系統適用性與儀器精密度試驗結果

2.2 定量限

取各成分對照品溶液，用稀釋劑不斷稀釋，精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，直至峰信噪比（S/N）≥10，計算各成分定量限和定量限濃度。配制6 份定量限溶液，精密量取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各成分峰面積RSD 和保留時間RSD。

結果表明：信噪比（S/N）≥10，6 份定量限溶液中各峰的保留時間RSD ≤1.0%，峰面積RSD ≤10%。定量限測定結果見表2。

表2 定量限測定結果

2.3 檢測限

取定量限項下的定量限溶液，用稀釋劑稀釋，精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，當信噪比（S/N）≥3，計算各成分檢測限和檢測限濃度。

檢測限測定結果見表3。

圖1 液相色譜圖

表3 檢測限測定結果

2.4 線性與范圍

精密量取對照品二級貯備液（25 μg/mL）0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL 和1.2 mL，分別置50 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

對上述溶液的濃度（x）與相應的峰面積（y）作線性回歸，計算回歸方程及其相關系數R、斜率K、截距。

結果表明各組分在00.6 μg/mL～0.6 μg/mL 濃度范圍內（相當于測定濃度0%～0.12%，相當于含量0%～0.12%，相當于限度濃度0%～120%），峰面積與濃度呈線性關系（R ＞0.998）。回歸方程與線性范圍見表4。

表4 各雜質回歸方程及相關系數

2.5 準確度

按照“1.3”介紹的方法，分別取供試品溶液、80%限度加標供試品溶液、100%限度加標供試品溶液、120%限度加標供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標法測定并計算含量，雜質甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽9 次測定的平均回收率分別為100.23%、98.58%、98.68%、99.69%、99.97%，RSD 值分別為1.20%、0.33%、0.86%、1.15%、0.82%。結果表明，該方法準確度均良好。

2.6 耐用性

分別調節流速為0.8 mL/min 與1.2 mL/min、柱溫20 ℃與30 ℃、pH=2.1 與pH=2.3、流動相比例緩沖液∶乙腈=98.5 ∶1.5 和緩沖液：乙腈=96.5 ∶3.5 時，進樣對照品溶液，結果表明，在上述各條件下進行試驗，甘氨酸色譜峰與各雜質分離度均大于1.5，該方法耐用性良好[6]。

2.7 溶液穩定性

取供試品溶液于25 ℃自動進樣器中，按照“1.3”介紹的方法，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 進樣分析，考察供試品溶液的穩定性。結果表明，各雜質在8 h 放置時間內，含量相對穩定。因此，供試品溶液配制完成后可在8 h 內測定。

2.8 供試品有關物質測定

取該品3 批，按照“1.2”介紹的供試品溶液的配制方法，按照“1.3”介紹的方法進行測定，雜質甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽以外的標法計算有關物質含量，其他單個最大雜質與總雜質以面積歸一化法測定，結果見表5。結果顯示，3 批甘氨酸有關物質測定結果均符合要求。

表5 甘氨酸有關物質測定結果

3 討論

該研究對甘氨酸中有關物質的檢測條件進行了優化，篩選了不同類別的色譜柱及流動相條件，最終以CenturySIL C18-AQ 作為分析柱時，色譜峰出峰快，分析周期短，基線平穩，且分離度各項指標滿足要求，色譜柱廉價、節約成本。由于甘氨酸及各雜質均為兩性化合物，分子極性較大，在C18 固定相中的保留較弱，在方法開發的過程中，加入了離子對試劑庚烷磺酸鈉，其庚烷基與色譜柱的固定相吸附結合，暴露出磺酸基負離子，吸附流動相中的陽離子被分析物，增強陽離子化合物的保留。該試驗中通過調節流動相pH 值，實現了甘氨酸和各雜質的有效分離。同時研究還發現，隨著柱溫的升高，各成分出峰時間縮短，柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃時，各色譜峰之間均能滿足分離的要求，綜合考慮選定柱溫為25 ℃。隨著流速的增加，各成分出峰時間縮短，各色譜峰之間滿足分離的要求，選定流速為1.0 mL/min。該方法簡便、準確，能夠為甘氨酸的質量控制提供依據。