一例紅色斑點叉尾鮰出血病的病原分析

張超

摘要：為明確重慶萬州某養殖場紅色斑點叉尾鮰（Red Ictalurus punctatus）出血性敗血癥的病因，為該病的防治提供參考，采用細菌的分離純化、生理生化試驗、16S rDNA和gyrB基因測序、動物回歸感染試驗對病原進行了鑒定，并采用紙片擴散法進行了藥敏試驗。結果：從患病紅色斑點叉尾鮰的內臟中分離獲得1株優勢菌，革蘭氏染色呈陰性，一般單個或呈雙存在，短桿狀，兩端鈍而圓;菌落圓形，表面光滑濕潤，邊遠整齊，β-溶血。能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇，不能分解阿拉伯糖、乳糖、纖維二糖;氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚試驗、VP試驗、七葉苷水解呈陽性;尿素酶、精氨酸雙水解酶呈陰性。16S rDNA和gyrB基因測序結果與維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）同源性最高，分別達99%和100%;回歸試驗攻毒組與臨床病例癥狀相似。藥敏試驗結果顯示該菌對恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢西叮、頭孢曲松、復方新諾明較為敏感。確定該例紅色斑點叉尾鮰的主要病原為維氏氣單胞菌。

關鍵詞：斑點叉尾鮰;維氏氣單胞菌;分離鑒定;藥敏試驗

斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦稱溝鯰（channel catfish），屬鯰形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae），原產于美國密西西比河，是美國淡水養殖的主要品種[1]。1984年引入中國，具有適應性廣、生長快、產量高、抗病力強、肉質上乘等優點，已在全國各地推廣[2]。紅色斑點叉尾鮰（Red Ictalurus punctatus），又稱美國紅鮰，簡稱紅鮰，是自然變異的斑點叉尾鮰經長期改良選育而成的一個品種，色彩艷麗，集觀賞美食于一體，市場推廣前景更優于普通的斑點叉尾鮰[3]。然而，由于養殖密度過大，水質管理不當、藥物使用不規范等原因，氣單胞菌屬（Aeromonas）致病菌導致的紅鮰疾病在某些養殖場仍呈高發趨勢，嚴重影響了紅鮰產業的健康發展。2019年3月，萬州某養殖場紅鮰出現了以細菌性敗血癥并發“腸套疊”為典型癥狀的死亡，文章對該病例的病原進行了系統的分離鑒定并開展了藥敏實驗，旨在為該病的防治提供一定的參考。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

病料采集自萬州某養殖場，健康斑點叉尾鮰（平均體長15.5±10 cm，平均體重35±5 g）購自當地水產品市場。培養瓊脂培養基、革蘭氏染色液、藥敏檢測試劑盒、細菌微量生化鑒定管均購于杭州天和微生物試劑有限公司，DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均為寶生物（大連）工程有限公司產品，引物及基因測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 細菌的分離純化

取典型癥狀的病魚，無菌操作取肝臟、脾臟、腎臟、腦劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，置28℃恒溫培養24 h，挑選形態一致的優勢菌落，劃線傳代培養2次，純化后的菌株轉接到營養瓊脂斜面培養基上，4℃冰箱保存備用[4]。

1.2.2? 生理生化鑒定

細菌生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[5]所述方法進行。

1.2.3? 16S rDNA和gyrB基因序列分析

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢菌株的DNA。16S rDNA基因PCR擴增引物參照分支桿菌[6]，反應條件略有改動。gyrB基因引物參參考Tac?o Marta [7]等，反應體系和條件同16S rDNA。PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，膠回收后克隆到T載體上，送至上海生物工程有限公司進行測序，測序結果用NCBI-Blast進行在線序列比對。

1.2.4? 回歸感染試驗

將市場上購買的60尾健康斑點叉尾鮰隨機分為4組，2組為攻毒組，2組為對照組。調整菌懸液濃度至1.0×108 CFU/mL，攻毒組每尾胸鰭基部注射0.2 mL菌液，對照組注射0.2 mL的生理鹽水。將試驗魚放置于水溫為25℃的養殖箱中，每天觀察并記錄魚的發病和死亡情況，持續時間為兩周，同時對瀕臨死亡或已死亡的魚進行剖檢和病原菌的再次分離鑒定。

1.2.5? 藥敏試驗

采用紙片擴散法。取濃度為1.0×108 CFU/mL的菌液0.2 mL均勻涂布于營養瓊脂培養基上，28℃恒溫培養箱中倒置培養24 h后觀察并記錄抑菌圈的直徑，敏感性判定參照試劑盒說明書。

2? 結果

2.1? 臨床癥狀

取池塘中患病斑點叉尾鮰進行剖檢，可見肝腎脾等主要臟器出現不同程度的充血、出血，邊緣張力明顯，并有局部壞死，尤其是脾臟更為明顯。可見腸道內充滿淡黃色膿性分泌物，腸壁稀薄，炎癥明顯，同時可以觀察到“腸套疊”。

2.2? 細菌形態

分離菌株革蘭氏染色呈陰性，一般單個或呈雙存在，短桿狀，兩端鈍而圓（圖1）。菌落呈圓形，表面光滑濕潤，邊遠整齊。在血平板上長勢良好，有β-溶血現象。

2.3? 生理生化特性

分離菌株能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇，不能分解阿拉伯糖、乳糖、纖維二糖。氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚試驗、VP試驗、七葉苷水解呈陽性，尿素酶、精氨酸雙水解酶呈陰性。結合菌落和細菌形態觀察，初步判定分離株為維氏氣單胞菌[8]。

2.4? 動物人工感染實驗

每日觀察并記錄實驗魚狀況，包括行為、癥狀和死亡情況。攻毒組斑點叉尾鮰在人工感染3 d后，出現活力下降，游動無力現象，體表和鰭條基部充血，5 d內發病魚占攻毒總數的70%，而注射無菌生理鹽水的對照組未見異常。可見表皮出血，全身各主要臟器充血腫大;再次分離到的菌株與原代菌株形態，生理生化和序列分析結果一致，說明分離株為該病例的致病病原。

2.5? 基因擴增結果

16S rDNA測序后獲得1505bp的基因片段，Blast結果與維氏氣單胞菌的同源性最高，達99%;gyrB序列為198bp，與維氏氣單胞菌同源性達100%（圖2）。

2.6? 藥敏試驗

分離株對10種抗菌藥的敏感性差異比較大。對恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢西叮、頭孢曲松、復方新諾明較為敏感，中度敏感的有苯唑西林、紅霉素、卡那霉素，對青霉素G、克林霉素、氨芐西林表現為耐藥。

3? 討論

細菌性敗血癥并發“腸套疊”為鮰魚的臨床常見癥狀，4～6月份高發，病程一般呈慢性經過，持續死魚達10天以上，累積死亡率達50%左右。從全國來看，各地發病癥狀有所差異，分離鑒定的主要病原也不盡相同，可能性病原有鮰魚愛德華氏菌、柱狀屈撓桿菌、氣單胞菌和嗜麥芽寡養單胞菌四類[9]。維氏氣單胞菌隸屬氣單胞菌屬，為典型的條件致病菌，能侵染大多數的淡水養殖魚類，尤其水質條件變差時，能引起魚類大批死亡[10]。

10種抗菌藥敏感試驗顯示，分離株對恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢西叮、頭孢曲松等較為敏感，對青霉素G、克林霉素、氨芐西林等6種藥物表現為耐藥，與高金偉等[8]的結果不一致，這可是流行株的區域分布差異造成的。2019年9月中華人民共和國農業農村部發布了最新的《水產養殖用藥明白紙》，水產上常用的三種抗菌藥為恩諾沙星、氟苯尼考和復方磺胺甲噁唑（復方新諾明），本實驗的結果表明分離株對這三種藥物敏感，臨床治療上應優先選用這三種抗菌藥。單純的細菌性出血病在比較容易治療，一旦誘發“腸套疊”，病程往往持續一個月以上，且治療效果往往不理想。生產上應以綜合防控為主：①定期檢測水質，采用微生態制劑調水;②在開食或轉食期間、疾病高發期間加強巡塘，做到對疾病的“早發現、早治療”;③日常投喂嚴格遵守“三看、四定”原則;④定期開展魚病檢查。

參考文獻

[1] 李林，嚴朝暉，肖友紅.斑點叉尾鮰國內市場現狀及產業發展前景淺析[J].中國水產，2012 （09）：35-36.

[2] 嚴朝暉，肖友紅，李林.世界鲇魚產業現狀及對我國斑點叉尾鮰產業市場定位的重新認識[J].中國水產，2013 （06）：36-40.

[3] 喬燕平，張晨晨.紅色和黑色斑點叉尾魚回人工繁殖試驗[J].水產科技情報， 2006（03）：118-120.

[4] 楊移斌，胥寧，董靖，等.斑點叉尾鮰病原中溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性分析[J].中國漁業質量與標準， 2017，7（04）：45-50.

[5]? 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社， 2001：114-116.

[6]? Ucko M， Colorni A， Kvitt H， Diamant? A ， et al. Strain variation in Mycobacterium marinum fish isolates[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（11）：5281-5287.

[7] Tac?o Marta， Alexandra M ， Artur A ， et al. Evaluation of 16S rDNA- and gyrB-DGGE for typing members of the genus Aeromonas[J]. FEMS Microbiology Letters，2005（246）：11-18.

[8] 高金偉，梁利國，王亞冰，等. 鱖源致病性維氏氣單胞菌的鑒定及藥敏試驗[J]. 微生物學通報，2016，043（12）：2686-2692.

[9] 蔡焰值，雷曉中，汪亮，等. 斑點叉尾鮰重要疾病發病原因及預防措施[J].湖北農業科學，2010. 49（11）：2867-2871.

[10] 陳昌福.我們應該如何反思斑點叉尾鮰大量死亡的現象.[J].當代水產，2017.42（06）：77-78.