三氧化二砷通過抑制血管內皮生長因子 mRNA表達抗骨髓增生異常綜合征血管新生作用的初步研究

石秋杰 羅瓊 尤學芬

[摘要] 目的 探討三氧化二砷通過下調人臍靜脈內皮細胞和SKM-1人骨髓增生異常綜合征細胞株（SKM-1細胞株）的血管內皮細胞生長因子mRNA表達，具有抗骨髓增生異常綜合征血管新生作用。方法 采用逆轉錄-聚合酶鏈反應擴增血管內皮細胞生長因子的方法。觀察：①不同濃度As2O3對A組（人臍靜脈內皮細胞）、B組（經SKM-1細胞株上清液干預人臍靜脈內皮細胞）及C組（SKM-1細胞株）血管內皮生長因子 mRNA的影響。②相同濃度下，三氧化二砷分別干預A、B及C 3組12、24、36、48、60、72 h后，其對血管內皮生長因子mRNA的影響。結果 ①隨著三氧化二砷作用濃度的增加，A、B、C 3組血管內皮生長因子 mRNA表達顯著下降，并呈負性相關關系（t=8.636、2.560、13.002，P<0.001）;②隨著三氧化二砷作用濃度和時間的增加，A、B及C 3組的血管內皮生長因子 mRNA表達均逐漸下降，呈顯著的負性相關關系（P<0.05）;③對A、B組表達結果進行比較B組血管內皮生長因子mRNA表達高于A組，差異有統計學意義（t=3.400，P<0.05）。結論 三氧化二砷可通過下調人臍靜脈內皮細胞和SKM-1細胞株的血管內皮生長因子轉錄和翻譯過程而實現抗血管新生作用，提示骨髓增生異常綜合征細胞可能分泌上調血管內皮細胞中血管內皮生長因子基因表達的物質，具有促進血管新生作用。

[關鍵詞] 三氧化二砷;人臍靜脈內皮細胞;血管內皮生長因子;SKM-1細胞株

[Abstract] Objective To investigate the role of arsenic trioxide in down-regulating the expression of vascular endothelial cell growth factor mRNA in human umbilical vein endothelial cells and SKM-1 human myelodysplastic syndrome cell line （SKM-1 cell line）， and have anti-myelodysplastic syndrome blood vessels rejuvenation. Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to amplify vascular endothelial cell growth factor. Observation 1.Different concentrations of As2O3 on vascular endothelial growth factor mRNA in group A （human umbilical vein endothelial cells）， group B （intervention of human umbilical vein endothelial cells via the supernatant of SKM-1 cell line） and group C （SKM-1 cell line） impact. 2.At the same concentration， the effects of arsenic trioxide on the vascular endothelial growth factor mRNA in groups A， B and C after 12 h， 24 h， 36 h， 48 h， 60 h， and 72 h， respectively. Results 1.With the increase of the concentration of arsenic trioxide， the expression of vascular endothelial growth factor mRNA in the three groups A， B， and C decreased significantly and showed a negative correlation （t=8.636， 2.560， 13.002， P<0.001）; 2.As the concentration and time of arsenic trioxide increased， the expression of vascular endothelial growth factor mRNA in the three groups A， B and C gradually decreased， showing a significant negative correlation （P<0.05）; 3.Comparison of the expression results in groups A and B B The expression of vascular endothelial growth factor mRNA in group was higher than that in group A， and there was a statistical difference （t=3.400， P<0.05）. Conclusion Arsenic trioxide can achieve anti-angiogenesis by down-regulating the transcription and translation of vascular endothelial growth factor in human umbilical vein endothelial cells and SKM-1 cell lines，and to suggest that myelodysplastic syndrome cells may secrete up-regulation of blood vessels in vascular endothelial cells endothelial growth factor gene expression substance has the role of promoting angiogenesis.

[Key words] Arsenic trioxide; Human umbilical vein endothelial cells; Vascular endothelial growth factor; SKM-1 cell line

大量研究表明，腫瘤的發生和發展伴有血管新生，多種血液系統惡性腫瘤同樣存在血管新生。骨髓增生異常綜合征（骨髓增生）是造血干細胞異質性的克隆性疾病，在疾病的發展過程中有一部分會進展為急性白血病，曾有研究表明骨髓增生存在血管新生，同時與疾病進展和轉化有密切關系[1]。血管新生對造血微環境的影響以及在腫瘤發生發展中的作用成為近年來研究的熱點。研究發現腫瘤細胞可通過自主分泌生長因子來刺激內皮細胞遷移和毛細血管的增生。在多種參與腫瘤血管形成的細胞因子中，血管內皮細胞因子（VEGF）是作用最強、特異性最高的促血管新生因子，在腫瘤的血管形成中起關鍵作用[2]。然而近年來As2O3在基礎研究及臨床應用中均顯示出較廣譜的抗腫瘤效應[3]。它作為一種新興的腫瘤血管生成抑制劑，其作用機制尚不明確。血管內皮細胞作為血管新生的靶細胞，該研究通過體外實驗檢測三氧化二砷對血管內皮細胞株和骨髓增生細胞株的生長抑制及VEGF基因表達的變化，進一步探討三氧化二砷的抗血管新生機制，現報道如下。

1? 材料與方法

1.1? 材料與分組

1.1.1? 細胞株及實驗分組? 該實驗研究對象為人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）和SKM-1細胞株。HUVEC購自武漢典型生物保藏中心（CCTCC），SKM-1購自日本JCRB細胞庫。

1.1.2? 實驗分組? ①A組：血管內皮細胞株（HUVEC）;②B組：血管內皮細胞株（HUVEC）與SKM-1細胞株上清液共同孵育;③C組：SKM-1細胞株。

1.1.3? 細胞株培養? 細胞株的培養和傳代 ①HUVCE細胞（A組）：HUVCE細胞以2×105個細胞/mL的終濃度接種于培養瓶，培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，總體積10 mL。②B組細胞：A組細胞以2×105個細胞/mL的終濃度接種于培養瓶，培養于含10%胎牛血清、30%SKM-1細胞培養上清夜的RPMI 1640培養液中，總體積10 mL。A、B組細胞均置于37℃，5%CO2，飽和濕度下培養3 d至對數生長期，留取標本備用。③SKM-1細胞（C組）：取對數生長期SKM-1細胞，新鮮培養液洗滌后，重懸于含20%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，以2×105個細胞/mL的終濃度接種于培養瓶，總體積10 mL。置于37℃，5% CO2，飽和濕度下培養3～4 d至對數生長期，留取標本備用。

1.2? 研究方法

利用GenBank數據庫中提供的VEGF、β-actin mRNA序列，經計算機引物設計網站設計引物，再經GenBank BLAST進行同源性檢測，由上海生物工程有限公司合成兩對引物，序列如下。

1.3? RT-PCR法半定量檢測法

①A、B和C組細胞在不同終濃度的As2O3條件下培養1 d，用RT-PCR法半定量檢測VEGF mRNA的表達變化。

②A、B、C組細胞株細胞在As2O3終濃度為12 μmol/L條件下培養12、24、36、48、60、72 h，用RT-PCR法半定量檢測各組各時間段VEGF mRNA的表達變化。

1.4? 統計方法

采用Stata 7.0統計學軟件進行數據分析。RT-PCR法半定量結果分析：直線相關分析藥物濃度-時間與VEGF表達強度的相關性;A組與B組均數比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? As2O3不同濃度處理后細胞VEGF基因的表達

①HUVEC和SKM-1細胞株均表達VEGF mRNA ;②隨著As2O3作用濃度的增加，A、B、C 3組VEGF mRNA表達顯著下降，并呈負性相關關系;③取As2O3不同濃度處理A、B、C 3組，對A、B組表達結果進行比較。統計結果示HUVEC中加入骨髓增生上清液后VEGF mRNA表達高于未加組，差異有統計學意義（t=3.400，P<0.05）。提示骨髓增生細胞可分泌上調血管內皮細胞中VEGF基因表達的物質，見表1、2。

2.2? As2O3不同時間處理后細胞VEGF基因的表達

As2O3作用時間的增加，A、B、C 3組VEGF mRNA表達也顯著下降， 并呈負性相關關系，見表3、4。

3? 討論

研究發現不同病期的骨髓增生患者骨髓微血管密度均高于正常對照組，存在血管新生現象[4]。抗血管新生治療在惡性血液病治療過程中其療效高于常規治療組，具有較好的臨床效果[5]。近年來有學者注意到三氧化二砷作用機制復雜，能通過抗腫瘤血管新生，抑制腫瘤生長、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制VEGF合成、抑制腫瘤細胞增殖和侵襲等多種機制起到抗腫瘤作用[6-7]。在骨髓增生的治療中，As2O3與HAG的治療效果相近，且不良反應較少[8]，同時As2O3聯合其他方案治療效果均優于單純標準方案，且不良反應較少[9-11]。三氧化二砷通過抑制腫瘤血管形成而影響腫瘤細胞的生長，但確切機制尚不清楚，該課題研究三氧化二砷對內皮細胞增殖及血管生成基因表達等方面的影響，探討其抗血管新生的作用機制。

VEGF是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，其在生理及病理狀態血管形成過程中發揮了關鍵性作用[12]。在惡性血液病患者臨床輔助診斷及預后評估中具有一定的應用價值[13]。VEGF與白血病的發生發展密切相關，可通過促進微血管的增生來調控白血病細胞的增殖分化，抑制VEGF 與其受體VEGFR 結合，從而阻止白血病細胞生長及血管生成，達到預防及治療白血病的目的[14]。

該研究應用RT-PCR半定量法檢測表明，HUVEC和SKM-1細胞株均表達VEGF mRNA。隨著As2O3作用濃度和時間的增加，HUVEC、SKM-1及SKM-1培養的HUVEC細胞株中VEGF mRNA表達逐漸下降;3組表達均與濃度、時間呈顯著的負性相關關系。因此，As2O3可同時通過下調HUVEC和SKM-1細胞株中VEGF mRNA表達而實現抗血管新生作用。與Kimura[15]研究顯示As2O3可下調細胞血管內皮生長因子表達相關轉錄因子HIF-1的活性，從而使腫瘤細胞VEGF的表達下降，結論一致。與相關研究[2]顯示高濃度As2O3可顯著抑制HUVEC增殖，且抑制作用具有時間及劑量依賴性（P<0.05），結論一致。同時發現SKM-1培養的HUVEC細胞株VEGF mRNA的表達高于HUVEC細胞株，提示骨髓增生細胞能分泌上調血管內皮細胞VEGF基因表達的細胞因子。根據羅瓊等人[16]的研究結果顯示，骨髓增生患者骨髓微血管密度（MVD）顯著高于正常對照組（P<0.01），隨著病程的進展患者的MVD呈增高趨勢（Rs=0.861 3，P<0.05）;②As2O3對HUVEC及SKM-1細胞株干預組的作用均表現時間、劑量依賴性的增殖抑制效應（F=10.92，P<0.05）;③HUVEC中加入SKM-1上清液共同培養對促進細胞生長有明顯作用（P<0.01）。

綜上所述，As2O3通過抑制血管內皮細胞生長，下調HUVEC和SKM-1細胞株中VEGF表達而減少VEGF產量，從而具有抗血管新生作用。

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（收稿日期：2020-12-04）