一種二苯乙烯羥胺類化合物的合成及其在糖類檢測中的應用研究

趙孔娥, 朱芳芳, 馬 傲, 朱 灝, 胡曉松

(武漢理工大學 化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070)

糖基化是修飾蛋白質的重要方式[1]。修飾后的蛋白質可參與到人體的各項生命活動中，如細胞識別、細胞免疫、信息傳遞等[2]。糖基化異常與很多疾病有關[2-3]。因此針對糖蛋白的聚糖進行監測分析對疾病的診斷與治療有重要意義。然而，由于糖類物質結構復雜、離子化效率較低，也不具備生色團，用常規的有機波譜分析方法開展其結構研究十分困難[4]。在分析聚糖前通常需要進行衍生化處理。近來，結合穩定的同位素標記的質譜分析成為定量糖組學研究中最可行的策略之一。對化學上相似的聚糖采用含“輕”和“重”的穩定同位素的衍生試劑進行衍生，不僅能有效消除電離效率的差異，還可以同時對多個樣品進行質譜分析，“輕”和“重”同位素標記的聚糖衍生物質譜峰具有明顯的質荷比區別；通過比較它們的相對強度，可以獲得具有相同化學特征的聚糖的相對含量。常見的用于聚糖定量分析的衍生方法包括全甲基化法[11]，還原胺化法[12-14]和腙化法[15]。所有這些定量策略都是通過用H和D(或12C和13C)修飾的同位素標記試劑和聚糖反應來實現的。

羥胺類化合物由于具有很高的親和性及其它特定的性質，在化學合成、藥物化學以及化學生物學方面得到了廣泛的應用[16]。O-取代和N-取代羥胺類衍生物已經在醛類化合物的檢測分析中取得了一系列成果[4,17-18]，也可以用于聚糖分子的衍生分析。在大多數情況下，O-取代羥胺類衍生化反應通過氨氧基與醛基反應形成肟，然后進一步被還原后進行定量分析。而N-取代的羥胺類衍生化反應是通過-NHOH與醛基反應形成硝酮類化合物，直接用于定量分析[17],也可以進一步被還原(Chart 1)。二苯乙烯的π共軛有機體系具有較高的光學可調控性和拓展性[19, 20]，是一個良好的熒光基團。二苯乙烯片段可以通過苯乙烯參與的Heck反應制得，如果選擇全氘代苯乙烯(styrene-d8)為原料，則可以制得氘標記的重原子同位素探針。基于這些分析，我們設計、合成了二苯乙烯類羥胺化合物(5a和5b, Scheme 1)，并初步用于糖類分子的檢測。

本文按照Scheme 1的合成路線合成了二苯乙烯類羥胺化合物：先以4-溴苯丙醇(1)和苯乙烯為原料，在醋酸鈀的催化下通過Heck反應得到(E)-3-(4-苯乙烯基苯基)丙烷-1-醇(2a)；2a被2-碘酰基苯甲酸(IBX)氧化為(E)-3-(4-苯乙烯基苯基)丙醛(3a)；3a再與鹽酸羥胺反應得到(E)-3-(4-苯乙烯基苯基)丙醛肟(4a)；丙醛肟4a在酸性條件下被氰基硼氫化鈉還原為(E)-N-(3-(4-苯乙烯基苯基)丙基)羥胺(5a)，總產率為4.8%。采用相同的路線，以全氘代苯乙烯為起始原料，合成了(E)-N-(3-(4-(2-(苯基-d5)乙烯基-1,2-d2)苯基)丙基)羥胺(5b)。化合物5a和5b可以分別作為“輕”和“重”的穩定同位素衍生試劑。化合物結構經1H NMR,13C NMR, IR和LC-MS(ESI)表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點儀；UV757CRT型紫外-可見分光光度計；Bruker AVANCE III 500 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片)；Triple TOFTM5600型質譜儀；G2-XS QTof型質譜儀；LS55型熒光/磷光/發光分光光度計；ZF-7A型手提式紫外分析儀。

4-溴苯丙醇(Adamas)；苯乙烯(Alfa Aesar)； 2-碘酰基苯甲酸(IBX)(Innochem)；叔丁醇(Aladdin)；鹽酸羥胺(阿拉丁)；氰基硼氫化鈉(Innochem)；N,N-二異丙基乙胺(上海秦巴化工有限公司)；三苯基膦(國藥集團化學試劑有限公司)；麥芽三糖(DP3)、麥芽五糖(DP5)和麥芽七糖(DP7)(西寶生物科技)；其余所用試劑均為化學純或分析純。

1.2 合成

(1)2a的合成

將化合物10.22 g(1.00 mmol)， 10 mol%Pd(OAc)222.45 mg(0.10 mmol)， 20 mol%乙酰丙酮20.01 mg(0.2 mmol)， 10 mol%四丁基溴化銨(TBAB)32.24 mg(0.1 mmol)， Cs2CO3651.64 mg加入DMSO(2 mL)中，氮氣保護下，加入苯乙烯312.45 mg(3.00 mmol)，于120 ℃反應2 h。冷卻至室溫，用EtOAc(100 mL)稀釋，依次用飽和氯化銨溶液(2×100 mL)，飽和食鹽水(2×100 mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品經硅膠柱層析純化得淡黃色固體2a，產率81.6%, Rf=0.38(石油醚/乙酸乙酯=3/1,V/V), m.p.73.9～75.0 ℃;1H NMR(500 MHz,CHLOROFORM-d)δ: 7.53(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.43～7.49(m,J=7.6 Hz, 2H), 7.37(t,J=7.2 Hz, 2H), 7.17～7.24(m,J=7.3 Hz, 2H), 7.04～7.15(m, 2H), 3.71(t,J=6.1 Hz, 2H), 2.74(t,J=7.5 Hz, 2H), 1.93(quin,J=6.9 Hz, 2H), 1.62(br s, 1H), 1.37(br. s, 1H), 0.10(s, 1H);13C NMR(126 MHz)δ: 141.4, 137.5, 135.1, 128.8, 128.6, 128.5, 128.0, 127.4, 126.6, 126.4, 77.3, 76.7, 62.2, 34.1, 31.8, 1.0; IRν: 3263, 3023, 2938, 2863, 2363, 1594, 1447, 1058,1016, 967, 812, 749, 692, 529 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H18O{[M+H]+}239.1436, found 239.1427。

Chart 1

Scheme 1

(2)3a的合成

依次將化合物2a0.10 g(0.42 mmol)、 IBX 0.24 g(0.84 mmol)加入13 mL叔丁醇中，回流(82 ℃)反應4 h(TLC檢測)。經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=6/1,V/V)純化得淡黃色粉末3a，產率64.6%, Rf=0.5(石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V), m.p.55.8～58.0 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.72(s, 1 H), 7.58(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.52(d,J=7.9 Hz, 2 H), 7.37(t,J=7.5 Hz, 3H), 7.16～7.32(m, 4H), 2.87(t,J=7.3 Hz, 2H), 2.78(t,J=7.3 Hz, 2H);13C NMR(126 MHz , DMSO-d6)δ: 203.2, 140.8, 137.6, 135.3, 129.1, 129.1, 128.7, 128.2, 128.0, 127.0, 126.8, 44.7, 40.5, 40.3, 40.2, 40.0, 39.8, 39.7, 27.7; IRν: 3024, 2929, 2850, 2820, 2721, 1713, 1595, 1513, 1489, 1449, 1405, 1388, 969, 819, 753, 691, 548 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H16O{[M+H]+}237.1279, found 237.1273。

(3)4a的合成

將化合物3a100.00 mg(0.43 mmol)加入混合溶劑(四氫呋喃/水=1/1,V/V)4 mL中，加入鹽酸羥胺45.00 mg(0.65 mmol)，用2 mol·L-1NaOH溶液調至pH 4,于室溫反應至終點(TLC檢測)。旋蒸除溶，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=6/1,V/V)純化得白色固體4a，產率45.7%, Rf=0.33(石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V), m.p.101.2～102.4 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 10.81(s, 1H), 7.59(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.53(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.37(t,J=7.6 Hz, 3H), 7.19～7.31(m, 4H), 6.68(t,J=5.2 Hz, 1H), 2.72～2.79(m, 2H), 2.53～2.60(m, 2H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 150.0, 141.3, 137.6, 135.3, 129.2, 129.1, 128.7, 128.2, 128.0, 127.0, 126.9, 40.5, 40.3, 40.2, 40.0, 39.8, 39.7, 31.7, 26.6; IRν: 3209, 3087, 3027, 2871, 2362, 1665, 1490, 1447, 1324, 1073, 966, 691 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H17NO{[M+H]+}252.1388, found 252.1379。

(4)5a和5b的合成(以5a為例)

將化合物4a33.7 mg(0.13 mmol)溶解于1 mL甲醇中，分批加入NaCNBH346.5 mg(0.74 mmol)，用氯化氫的飽和甲醇溶液調至pH為弱酸性，反應6 h。旋蒸除溶，殘余物預過柱，收集有機層再經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=2/1,V/V)純化得化合物5a，產率20%, Rf=0.3(石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V), m.p.111.2～113.0 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.58(d,J=7.3 Hz, 2H),7.41～7.54(m, 2H), 7.36(t,J=7.5 Hz, 2H), 7.09～7.31(m, 5H), 2.67～2.76(m, 1H), 2.57～2.65(m, 2H), 1.64～1.88(m, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 141.2, 141.0, 137.6, 135.4, 131.7, 131.1, 129.2, 129.2, 128.7, 128.2, 128.0, 128.0, 127.1, 127.0, 126.9, 126.8, 56.7, 56.6, 40.5, 40.3, 40.2, 40.0, 39.7, 32.3, 31.9, 26.5, 26.4; IRν: 3023, 2854, 2364, 2329, 1726, 1549, 1452, 1373, 1265, 1105, 1075, 964, 809 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H19NO{[M+H]+}254.1545, found 254.1539。

用類似的方法合成5b, Rf=0.3(石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V), m.p.148.2～150.3 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.59, 9.17(d,J=4.0 Hz, 1H), 7.56～7.51(m,J=7.9 Hz, 2H), 7.24～7.19(m,J=8.2 Hz, 2H), 2.94～2.81(m, 2H), 2.68～2.57(m, 2H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 140.6, 136.9, 134.8, 128.6, 56.2, 40.0, 39.8, 39.7, 39.3, 39.2, 39.0, 31.8, 25.9; LC-MSm/z: calcd ford7-C17H12NO{[M+H]+}261.1984, found 261.1982。

1.3 性能測試

(1) UV-Vis

分別使用乙腈和DMSO配制5.0 μmol·L-1化合物5a的溶液。并分別以乙腈和DMSO作為空白對照，在260～400 nm掃描UV-Vis譜圖。

(2) FL

使用DMSO配制1.0 μmol·L-1化合物5a的溶液，在230～500 nm掃描FL譜圖。

(3) 熒光量子產率[21]

配制1.0μmol·L-1化合物5a的DMSO溶液作為待測溶液，2.0 μmol·L-1硫酸奎寧的0.1 mol·L-1硫酸溶液作為標準溶液，測定吸光度和折射率，并計算發射峰積分面積。

(4)5a與麥芽三糖衍生體系的熒光性能

將20 μL 化合物5a(1 mmol·L-1)、 10 μL 0.01 mmol·L-1DP3溶液和10 μLNH4Ac/HAc(0.2 mol·L-1, pH=3.5)混合均勻，于60 ℃反應5 h。每隔1 h取樣，在230～500 nm掃描FL譜圖。

(5)5a與聚糖衍生反應

將20 μL 化合物5a(1 mmol·L-1)、 10 μL 0.01 mmol·L-1聚糖混合溶液(DP3、 DP5和DP7)與10 μL NH4Ac/HAc(0.2 mol·L-1, pH=3.5)混合均勻,于60 ℃反應3 h。濃縮，真空干燥，加入10%乙腈溶液，經0.22 μm尼龍濾膜過濾，進行質譜檢測。

(6)1H和D標記的二苯乙烯羥胺化合物與DP5衍生反應

將20 μL同位素標記混合物(化合物5a/5b=1/1, 1 mmol·L-1)、 10 μL 0.01 mmol·L-1DP5溶液和10 μL NH4Ac/HAc(0.2 mol·L-1, pH=3.5)混合均勻,于60 ℃反應3 h。濃縮，真空干燥，加入10%乙腈溶液，經0.22 μm尼龍濾膜過濾，進行質譜檢測。

2 結果與討論

2.1 合成

以4-溴苯丙醇為初始原料，嘗試以兩種不同的Heck反應條件合成化合物2a。首先用醋酸鈀，三苯基膦和N,N-二異丙基乙胺作催化劑，產率較低(23.8%)；后來采用醋酸鈀，四丁基溴化銨和碳酸銫作催化劑，產率較高(81.6%)。原料中的溴原子為Heck反應提供了便利條件，確保醋酸鈀中的鈀元素由二價態轉化為零價態，使得催化反應可以順利進行。雖然構建二苯乙烯結構乙烯橋的方法有很多，如Wittig反應[22]，Heck反應[23]和Suzuki反應[24]等，但文獻[25-26]表明使用Heck反應合成E-型苯乙烯基化合物的效率最高。

化合物3a可以通過氧化2a得到。本文采用氯鉻酸吡啶鹽(PCC)和鄰碘酰基苯甲酸兩種不同的氧化劑進行了氧化反應。以PCC為氧化劑時，反應時長為3 h，產率為40%；以鄰碘酰基苯甲酸為氧化劑時，反應時長縮短至2 h，產率升高至64.6%，且操作簡便。因此最終采用鄰碘酰基苯甲酸作為氧化劑。

化合物3a經過肟化反應和還原反應分別得到化合物4a和5a。由于反應原料在氯化氫/甲醇飽和溶液中的溶解度不高，導致反應產率較低。由化合物5a的傅里葉紅外光譜可知，其烯烴結構的=C—H面外搖擺振動在964 cm-1處有一個強的吸收峰，在730～650 cm-1沒有弱且寬的吸收峰，因此可判定其雙鍵為反式結構。

2.2 紫外-可見吸收光譜

化合物5a的UV-Vis譜圖如圖1所示。由圖1可見，化合物5a在乙腈和DMSO中的主要特征吸收峰均為兩個，這證明了分子內存在不同類型的電子躍遷。化合物5a在DMSO中的吸收峰位于302 nm和312 nm，在乙腈中位于300 nm和310 nm。受溶劑效應影響，化合物5a在乙腈中的吸收峰相比于DMSO中的吸收峰發生了藍(紫)移，吸收峰強度也更強。

λ/nm

2.3 熒光光譜和熒光量子產率

化合物5a在DMSO中的熒光激發和發射光譜如圖2所示。其激發波長為312 nm，發射波長為357 nm，斯托克斯位移為45 nm(表1)。使用硫酸奎寧作為標準品，測得化合物5a的熒光量子產率為0.11，摩爾吸光系數為1.02×104cm-1·mol-1·L。

λ/nm

表1 化合物4的物理化學性質

2.4 5a與麥芽三糖衍生體系熒光隨時間的變化

化合物5a熒光性能較好，斯托克斯位移為45 nm，且具有較強的抗背景干擾能力。我們期望化合物5a與糖的衍生產物也具有良好的熒光性能。但是由圖3可以看出，隨著反應時間的延長，反應體系的熒光強度在逐漸降低，3 h之后熒光強度幾乎不再改變，說明化合物5a與麥芽糖的衍生反應沒有生成熒光性能顯著增強的衍生產物。

λ/nm圖3 5a與DP3衍生體系的FL譜圖

2.5 聚糖衍生物的質譜分析

雖然化合物5a很難用于聚糖分子基于熒光衍生的相關研究，但仍能通過衍生產物的質譜來實現聚糖的檢測和定量分析。化合物5a分別與麥芽三糖(DP3)、麥芽五糖(DP5)和麥芽七糖(DP7)進行衍生化反應后，所得到的衍生產物對應的質譜峰強度較高(圖4)。質譜結果顯示，化合物5a與聚糖衍生同時被還原，衍生產物質譜峰的質荷比相較于理論值增加了兩個氫原子的原子量(表2)，這可能是衍生反應得到的硝酮在質譜離子化過程中進一步還原的結果(圖5)。

圖 4 化合物5a與DP3、 DP5、 DP7衍生物的MS譜圖

Figure 4 MS spectrometry of the derivatives of 5a and DP3, DP5, DP7

圖5 化合物5a與聚糖的硝酮化反應和還原反應

表 2 化合物5a與聚糖衍生物的質譜數據

2.6 1H和D標記的二苯乙烯羥胺化合物與DP5衍生反應的質譜

近年來，穩定同位素標記的試劑已被證明是對簡單和復雜混合物中N-連接聚糖進行相對定量的可行策略[21-24]。化合物5a和5b等量混合后與DP5進行衍生化反應，得到的衍生物的質譜圖如圖6所示。5a和5b與DP5的衍生物加氫峰的質荷比分別為1066.4244和1073.4739，相差為7，強度比接近1。衍生條件相對溫和，質譜信號的強度高，“輕”質和“重”質同位素標記的二苯乙烯羥胺探針能夠較好的標記聚糖，衍生產物的離子化效果基本相同，可以將成對出現、質荷比相差為7的質譜峰的信號強度用于定量分析的依據。這說明該類探針在聚糖的定量分析中有比較廣闊的應用前景。

m/z

設計并合成了新型二苯乙烯類羥胺化合物(化合物5a,5b)。化合物5a的激發波長為312 nm，發射波長為357 nm，斯托克斯位移為45 nm，熒光量子產率為0.11，在發生衍生反應之前具有較好的熒光性能。5a和5b按1/1與麥芽五糖進行衍生化反應時，得到了成對出現，分子量相差為7的穩定同位素標記產物。這些質譜信號的強度可以作為定量分析的依據，“輕”質和“重”質同位素標記的化合物5a和5b聯合使用時，可以基于硝酮化反應和質譜技術，在聚糖和其它醛類分子的定量分析中發揮作用。我們將在后期的工作中引入四苯乙烯或其它熒光性能更好的砌塊，從而得到既能作為熒光探針，又可以用于質譜分析的多功能分子，進一步拓展其在糖類檢測中的應用。