不同廠家十滴水微生物限度檢查方法的驗證與評價

胡 翮，郭 沛，何 碩，李 昂

（湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411100）

十滴水是生活中常見的祛暑藥，由樟腦、干姜、大黃、小茴香、肉桂、辣椒等組方，主要用于傷暑引起的頭暈、惡心、腹痛、胃腸不適等[1]449。由于藥品的微生物檢測結果受多種因素影響，考慮到該類藥品本身的抑菌性和不同廠家生產工藝的差異，故建立經過驗證適宜的微生物檢驗方法十分必要。根據2015 年版《中國藥典(一部)》的要求，本研究中對5 個不同廠家十滴水的微生物檢驗方法進行了驗證試驗，為建立合適的微生物檢驗方法提供參考，并對不同廠家的產品抑菌性及驗證結果予以評價。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

儀器：BL －100G 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；HF－safe －1200LC 型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；XY600 －1B 型電子天平（常州幸運電子設備公司，精度為0.1 g）；SPX－250 型生化培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；MJX－250B型霉菌培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

試藥：十滴水（A 廠，批號為180318；B 廠，批號為20180106；C 廠，批號為180505；D 廠，批號為180412；E廠，批號為180213）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為180427），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為180912），胰酪大豆胨液體培養基（批號為180820），沙氏葡萄糖液體培養基（批號為180731），腸道菌增菌液體培養基（批號為180813），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號為180627），麥康凱瓊脂培養基（批號為180904），麥康凱液體培養基（批號為180820），氯化鈉－蛋白胨緩沖液（pH ＝7，批號為180820），均購自北京陸橋公司。

菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) [CMCC（B）10104]，枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis)[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉菌（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]，大 腸 埃 希 菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，均來自中國醫學細菌保藏中心。

2 方法與結果

2.1 常規法驗證

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用10 倍0.9%氯化鈉溶液稀釋成一定濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物，加入3 ～5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。采用適宜的方法吸出孢子懸液置無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9%氧化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

試驗組中，以無菌操作取樣品10 mL，加氯化鈉－蛋白胨緩沖液(pH ＝7.0)稀釋至100 mL，制成1 ∶10(V／ V)的供試液，分別取該供試液9.9 mL，加入以上5 種代表試驗菌株0.1mL（供試液含菌量不大于100cfu／mL），吸取1 mL，注入平皿中，平行制備2 個平皿，傾注15 ～20 mL 融化并冷卻至約45 ℃的瓊脂培養基（加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的平皿傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基；加入白色念珠菌和黑曲霉的平皿傾，注沙氏葡萄糖瓊脂培養基），待凝固后置規定溫度培養并觀察結果。供試品對照組中，取供試液，以相應稀釋液代替菌液同試驗組操作。菌液對照組中，取相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作方法加入試驗菌液，并進行微生物回收試驗。結果見表1。

表1 各批樣品需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數的常規法驗證結果（%）

可見，5 個廠家的供試品分別接種5 種試驗菌后，需氧菌總數和霉菌酵母菌總數計數的回收率均小于50%，說明產品有抑菌作用，且A，C，D 3 個廠家的抑菌作用更強。因此，調整試驗方案，對A，C，D 3 個廠家直接用薄膜過濾法進行驗證，對B，E 2 個廠家的微生物計數采用培養基稀釋法進行驗證。

2.2 培養基稀釋法驗證

試驗組中，分別取B 廠和E 廠的1 ∶10( V／ V)供試液各9.9 mL，加入5 種代表試驗菌株0.1 mL（每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu），吸取該供試液0.2 mL注入平皿中，加入15 ～20 mL 營養瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養、觀察，并進行菌數計數。供試品對照組中，取制備好的供試液，以相應稀釋液代替菌液同試驗組操作。菌液對照組中，以相應稀釋液代替供試液，按試驗組操作方法加入試驗菌液，并進行微生物回收試驗。結果見表2。可見，使用培養基稀釋法仍有部分菌株回收率未達50%。

表2 各批樣品需氧菌總數、菌和酵母菌總數計數的培養基稀釋法驗證結果（%）

2.3 薄膜過濾法驗證

試驗組中，取適量氯化鈉－蛋白胨緩沖液(pH ＝7.0)潤濕濾膜，將5 個不同廠家的1 ∶10( V／ V)供試液各9.9 mL 加入濾器中，分別以氯化鈉－蛋白胨緩沖液(pH ＝7.0)100，200，300 mL 作為沖洗液，分次沖洗濾膜，在最后1 次沖洗液中加入0.1 mL 不大于100 cfu 的待測菌株，沖洗后取出濾膜，貼于規定的培養基上培養，并觀察和計數。供試品對照組中，取1 ∶10( V／ V)供試液10 mL 加入濾器中，分別以氯化鈉－蛋白胨緩沖液(pH ＝7.0)100，200，300 mL 作為沖洗液，分次沖洗后，取出濾膜，貼于規定的培養基上培養，并觀察和計數。菌液對照組中，取相應稀釋液代替供試液，按試驗組操作方法加入試驗菌液，并進行微生物回收試驗。結果見表3。

表3 各批樣品需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數的薄膜過濾法驗證結果（%）

可見，5 個不同廠家的樣品經不同體積沖洗液薄膜過濾后，不同菌株之間驗證結果存在一定差異。當沖洗量為100 mL 時，各廠家均不能達到規定的回收率，說明樣品仍有一定的抑菌作用。當沖洗量為200 mL 時，B 廠樣品5 種菌株的回收率均高于50%，說明可用此經過驗證的方法用于該廠家的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數，而其他廠家還應適量擴大沖洗量。當沖洗量達到300 mL 時，5 個廠家產品對5 種試驗代表菌株的回收率均能達到50%以上。

2.4 控制菌檢查方法驗證

試驗組中，將5 個不同廠家的1 ∶10( V／ V)供試液各9.9 mL 加入濾器中，B 廠的以氯化鈉－蛋白胨緩沖液(pH ＝7.0)200 mL 作為沖洗液，A，C，D，E 廠的以氯化鈉－蛋白胨緩沖液(pH ＝7.0)300 mL 作為沖洗液，分次沖洗濾膜，在最后1 次沖洗液中加入0.1 mL 不大于100 cfu的大腸埃希菌，沖洗后取出濾膜，貼于規定的培養基上培養并觀察結果。陽性對照組中，取相應稀釋液代替供試液，按試驗組中方法試驗，在最后1 次沖洗液中加入不大于100 cfu 的大腸埃希菌，沖洗后取出濾膜，貼于規定的培養基上培養并觀察結果。陰性對照組中，取相應稀釋液代替供試液，按試驗組中方法進行薄膜過濾，但不加菌液，待沖洗完成后取出濾膜，貼于規定的培養基上培養并觀察。結果見表4。

表4 大腸埃希菌驗證結果

3 討論

3.1 驗證結果

本研究結果顯示，常規法和培養基稀釋法均不適用于該5 個廠家十滴水的微生物限度及控制菌檢查；采用薄膜過濾法后，各廠家的各試驗菌的回收率均符合要求。可見，A，C，D 3 個廠家的供試液常規法試驗的抑菌作用相對較強，回收率非常低，故直接采用薄膜過濾法。B，E 2 個廠家的供試液經培養基稀釋法驗證后，有部分菌株不能達到規定的回收率標準，故將5 個廠家的產品均進行薄膜過濾法試驗。除B 廠的供試液沖洗量為200 mL時可滿足試驗要求外，其他廠家的供試液所用稀釋液沖洗量均為300 mL 才能去除其抑菌作用。因此，因各廠家的產生環境、制備工藝、原輔料質量及供試品的理化特性等可能存在差異，對微生物限度檢查的產品均應進行方法驗證，以確認所采用方法適用于該產品的微生物檢查。

3.2 驗證方法選擇

按2015 年版《中國藥典(一部)》要求，選擇適宜的陽性菌株[1]140，對5 個不同廠家的樣品同時進行驗證與比較。優先考慮常規法驗證，若驗證結果不能滿足試驗要求，對于抑菌作用相對較強的，采用培養基稀釋法再驗證；而對于抑菌作用很強的，則考慮采用薄膜過濾法來消除其抑菌作用。參考文獻[2 －7]進行比較和研究，對試驗方案進行設計和調整，文中驗證思路和試驗方法可對該品種微生物檢查方法的驗證提供參考，以提高微生物的檢出率，更好地控制藥品的質量。

3.3 驗證過程中應注意的問題

菌液：制備試驗菌液時，應提前確定菌液濃度，進行菌數測定，并與試驗組菌數測定同時進行，精確測定菌數是回收率測定的關鍵步驟。由于加入菌液體積較小，對檢測結果影響較大，因此必須嚴格控制菌液加入量，有必要采用商品化的定量菌株[8]。試驗要求的加菌量一般不大于100 cfu，以便于計數，菌量太大或太小均可能導致誤差增加。

樣品：樣品的微生物限度檢查驗證試驗應進行3 次獨立的平行試驗。樣品稀釋后應混合均勻[9]。此外，采用薄膜過濾法時，沖洗時應分次沖洗，且沖洗量不宜過大，總沖洗量不得超過1 000 mL，以免濾膜上的微生物受損傷[2]。

培養基與培養時間：試驗用培養基可按2015 年版《中國藥典（四部）》非無菌產品微生物限度檢查法中培養基適用性檢查項下進行驗證試驗，以確保檢測結果的準確性。此外，在適宜培養條件下，微生物的群體生長數量與培養時間遵循生長曲線規律[10]，處于指數生長期的代謝旺盛，生長迅速，個體形態、生化特征較一致，是微生物檢驗鑒定的理想狀態[11]，尤其當菌落在培養基上不宜辨別時，可適當延長培養時間，有利于微生物的檢出[12]。

濾膜：本研究中對比了2 個廠家的不同型號濾膜，發現有的濾膜不能起到很好的過濾作用。因十滴水的主要溶劑為70%乙醇，應充分考慮濾膜材質對溶劑兼容性和濾膜對微生物截留能力的影響。