單純皰疹病毒復制機制的研究進展

胡雅涵　匡琳

摘 要 單純皰疹病毒（herpes simplex viruses， HSV）是導致機體感染的常見病原體，一旦侵入人體并終身潛伏，當機體免疫力下降時，迅速復制引起臨床癥狀。探明其復制機理尤為重要。本文就單純皰疹病毒的復制機制，及主要參與影響轉錄合成的產物進行綜述。

關鍵詞 單純皰疹病毒 病毒復制 病毒蛋白 綜述

中圖分類號：R730文獻標識碼：A

單純皰疹病毒（herpes simplex viruses， HSV）是感染人體的一種常見病原體，為線性雙鏈DNA病毒，有囊膜，屬于皰疹病毒科 亞科的病毒。根據病毒血清型的不同，將其分為Ⅰ型和Ⅱ型單純皰疹病毒，引起口腔和生殖器的損傷。HSV主要通過接觸感染，在人體內可表現為兩種感染形式：溶細胞裂解和潛伏感染。在上皮細胞中HSV進行裂解復制，而在感覺神經元中病毒則進入潛伏期，當受到外界刺激，免疫抑制及勞累時，病毒就能重新激活，引起臨床癥狀。這兩種狀態在一定條件下反復交替出現，是HSV感染患者復發的原因。

HSV的增殖復制主要與病毒自身的調節蛋白和特定的細胞內分子彼此之間互相作用有關，是由其而引發的一系列轉錄事件，然而，對于病毒是如何在潛伏狀態下參與轉錄和復制的過程并不是很清楚。而單純皰疹病毒的復制與其他DNA雙鏈相比，涉及其過程的基因產物多達至少84種，較為復雜，所以了解它的復制過程尤為重要。

1 HSV的基因結構

HSV為皰疹病毒家族的一部分，也具有皰疹病毒共有的結構，由內向外依次為病毒核心、衣殼、內膜和囊膜。HSV-1的基因組結構是由兩個相對獨立的長片段（UL）、短片段（US）和包繞在兩端的反轉重復序列構成。見圖1。由于反轉序列重組方式的差異，存在4種同分異構體，且一般同時存在。病毒DNA有環形、線形兩種存在形式。在HSV的DNA進入感染細胞核內后，立即進行環化。

其病毒結構是由大量不同的蛋白整合而成的，分為衣殼（Capsid）、皮層（Tegument）、囊膜（Envelop），囊膜上存在有許多突起（Spike），見圖2。病毒糖蛋白存在于囊膜中的突起上，結構蛋白（Virus Protein，VP蛋白）基本存在于衣殼與皮層中。

HSV基因根據轉錄激活的時間先后順序分為即刻早期基因（Immediate Early Genes，IE or）、早期基因（ Early Gene，E or）、晚期基因（ Late Gene，L or）三類。其中 或立早基因的表達與病毒基因的表達相關，調控病毒復制; 或早期基因的表達涉及到病毒DNA的復制，合成和包裝;晚期基因表達為合成病毒結構蛋白。在潛伏期感染時，病毒不復制，大部分基因的轉錄也被抑制，潛伏性相關轉錄本（Latency Associated transcript，LAT）是唯一大量表達的基因。

在涉及單純皰疹病毒復制的84個已知的多肽中，至少有47個不需要病毒在培養細胞中復制，這些基因在最終分化的細胞中沒有表達;另一些基因則改變細胞代謝以確保高的病毒產量，缺乏這些基因的變異病毒在自然界中無法生存。

2 HSV的復制機制

HSV與其他病毒的復制過程相同，分為吸附、穿入、生物合成、組裝、釋放。

2.1吸附與穿入

目前發現HSV侵入細胞的方式有兩種。一種是通過受體途徑，病毒通過糖蛋白與宿主細胞表面的特異性受體識別并結合，囊膜與細胞膜融合，病毒被包裹進入細胞。這是HSV進入細胞的主要經典途徑，首先需要gB和gC對位于細胞膜上的糖胺聚糖（glycosaminoglycan）進行識別并結合，由其是在其表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），使病毒吸附在細胞膜表面。病毒完成進入細胞的過程需要病毒囊膜上的gD、gB與異質二聚體gH /gL四種糖蛋白共同作用，gD糖蛋白與細胞表面的受體黏連蛋白1/2（Nectin1/2）、皰疹病毒進入中介蛋白（Herpesvirus entry mediator，HVEM）、3-O硫酸乙酰肝素（3-O- sulfated heparansulfate，3-OH-HS）結合后，發生構象的改變，促進gB與gH-gL二聚體相互作用，使囊膜與細胞膜融合。另一種方式是通過吞噬作用使病毒進入細胞。

在其融合過程中，有研究還提示gM，gK，UL11，UL20等也參與了細胞的融合過程。通過相互免疫共沉淀實驗和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）下拉實驗，證實了gk與UL20之間的直接蛋白相互作用。兩者協同在細胞表面表達病毒誘導的細胞融合。實驗表明缺乏gM或UL 11的突變病毒進入Vero細胞的動力學比親本病毒慢，說明gM和UL 11在病毒誘導的細胞融合和病毒進入過程中都參與了膜融合現象。

糖蛋白在此過程中不可或缺，介導HSV附著和滲透到細胞中，并引發宿主免疫反應。目前已有12種已知的病毒糖蛋白（B-N）。這些糖蛋白與病毒吸附、入侵細胞、出芽、細胞-細胞間擴散及免疫逃逸等相關。gB介導融合、穿入和胞間擴散，并引發病毒的循環復制;gC參與吸附并介導感染與免疫逃避;gD參與病毒復制和刺激中和抗體的產生;gE/gI復合物參與并介導了HSV在細胞和傳導通路中的胞間擴散;gG介導在CNS中，病毒的復制過程;gH/gL復合物在病毒感染中是不可或缺的成分，在宿主的免疫反應中是主要抗原，能使吸附穩定，誘導融合;gK在病毒復制中發揮著極為重大的作用，同時參與細胞內病毒的包膜合成，轉運及釋放。gM/gN均在病毒復制的過程中，都不是必要的，但在缺少時，會導致病毒的穿膜速度減慢。見表3。

2.2脫殼

在病毒進入宿主細胞后，囊膜脫去，皮層和核衣殼釋放到細胞質，病毒核心沿著細胞的微管網絡被轉移到細胞核中，大部分的病毒蛋白會從衣殼中分離，而UL 36和UL 37仍與傳入的HSV-1衣殼相關，并有助于衣殼向核內轉運，之后，病毒DNA將通過核孔注入細胞核。VP1-2是UL36基因編碼的最大的外殼蛋白，表達為 （晚期）基因，使蛋白水解裂解，從而讓HSV-1 DNA釋放進入細胞核。

在運輸過程中，有兩種蛋白起著關鍵的作用：VP16和病毒宿主關閉蛋白（Vhs），分別起著激活病毒基因表達和降解宿主細胞的mRNA的作用。VP16為UL48基因表達的病毒間層蛋白，能與病毒 基因結合使基因開始表達。當HSV侵入細胞，脫掉外層的核殼體后，VP16與宿主細胞因子Oct-1和HCF-1結合，形成誘導復合物，并與病毒 基因的轉錄激活元件TAATGA-RATTC結合，從而啟動基因表達。并且，VP16轉錄激活域有多重作用，首先它能與基本轉錄因子和 基因啟動子的輔激活物相互作用，調節組蛋白3（H3）的甲基化和去甲基化過程，并且還能通過與HAT作用，使組蛋白和這些啟動子的結合率大幅度下降，繼而啟動基因的轉錄。

Vhs是一種由UL41基因編碼的內切核糖核酸酶，是最重要的初級蛋白，最早啟動細胞基因表達攻擊，主要在感染的早期和早期階段合成，在HSV的發病、毒力和復制過程中發揮極其關鍵的作用。它能夠降解所有類型的RNA，但在受感染的細胞中，vhs只會破壞mRNA來減少細胞翻譯的病毒競爭，從而更容易建立和促進病毒感染的進展。相反，Vhs通過穩定gE/gL復合物使病毒mRNA高度穩定，而gE/gL復合物是細胞間傳播所必需的。它能減少先天和適應性免疫應答蛋白的合成，從而阻斷I型干擾素系統、樹突狀細胞并減少促炎細胞因子和趨化因子的產生。

2.3病毒的轉錄和表達

病毒在進入細胞核后，在宿主連接酶的作用下會迅速環化，VP16首先激活病毒基因轉錄活性，招募轉錄相關蛋白因子使立即早期基因開始轉錄，并最先表達出ICP0。ICP0能激活HSV 的E基因和L基因的表達，激活病毒基因組的轉錄。隨之ICP22激活ICP0， ， 基因的轉錄，在宿主細胞RNA聚合酶II的催化下，轉錄成病毒mRNA。

三種基因之間相互作用，在DNA復制前，首先會有 基因的轉錄，調節著 基因和 基因的表達， 、 基因的轉錄分別需要 、 蛋白的存在，也會使 、 蛋白后期的合成速度下降。

基因最先轉錄，同時，也是最先表達的基因，它有啟動、指導 和 基因的轉錄表達作用，表達成6種多肽：ICP0，ICP4，ICP22，ICP27，ICP47，Us1.5。在這6種多肽中，除去ICP47，其余5種都與基因的轉錄調節密切相關。ICP0、 ICP4和ICP27調控早期和晚期病毒基因的基因表達和轉錄;ICP22和US1.5在病毒感染過程中，對細胞凋亡分別存在有對抗和促進的作用。

基因表達的 蛋白質主要參與病毒基因組復制（例如：HSV DNA聚合酶，UL30）、核昔酸代謝（如胸昔激酶UL23），抑制早期的 基因的表達和激活 基因。 蛋白的表達標志著病毒DNA開始復制和 基因表達。病毒DNA在核內W圓環機制復制。最后是 基因的轉錄，在 、 多肽的作用下，表達病毒的衣殼結構蛋白、被膜蛋白和參與衣殼裝配與轉運的蛋白。

ICP0在潛伏性感染與裂解性感染之間，調節著他們的平衡，在HSV的活化成感染狀態的調控中發揮著及其重要的作用，并能在早期破壞ND10。ICP0 具有E3泛素連接酶（ubiquitin-ligase enzymes）的功能，首先，它對病毒基因的轉錄和表達有調節作用;其次，它還能和宿主細胞內的多種蛋白之間彼此互相作用，從而激活轉錄過程。并且誘導泛素依賴性蛋白質降解，間接調控細胞周期、病毒增殖等。最重要的一點，ICP0 可以影響干擾素通路，消除干擾素刺激應答基因（interfron? stimulated? gene，ISG）的抗病毒功能;同時介入NF- B和AP-1 信號通路，在HSV-1 與HIV-1 的超感染過程中，作為超感染因子激活HIV-1 的長末端重復序列（long terminal repeat，LTR）。

ICP22在病毒早期基因、晚期基因的表達中起著關鍵的作用，而且潛伏病毒的再激活也與之密切相關。ICP22基因編碼區能編碼兩種蛋白質：ICP22和Us1.5。在病毒感染過程中，ICP22對細胞凋亡同時存在對抗與促進作用。在感染早期，ICP22與ICP27等蛋白對細胞凋亡起著對抗作用;但在感染后期，Us1.5與UL13蛋白等共同激活Caspace3，對細胞凋亡起著促進作用。同時，ICP22 還能和細胞周期蛋白依賴性激酶Cdc2共同發揮作用，加速溶胞途徑。ICP22單獨作用并不常見，更多的是和其他病毒蛋白共同作用，它無論對于細胞啟動子還是病毒啟動子均具有廣泛的轉錄抑制作用，VP16能夠特異性地解除ICP22對病毒立即早期基因表達的抑制作用。在HIV的感染過程中，ICP22與VP16兩者相互作用，使宿主細胞的蛋白合成迅速減少，幫助病毒基因轉錄而抑制宿主基因轉錄，更有利于病毒的復制。

ICP27是一種由UL54基因編碼的核質穿梭蛋白，多功能的基因表達調控因子，在感染期間起著重要作用， 主要調節病毒和宿主細胞mRNA的合成與成熟，最主要功能是將病毒mRNA從細胞核運輸到細胞質，其中最值得注意的是對病毒早期及晚期基因表達的調節作用。它對I基因和E基因有抑制作用，使L基因活化，并促進E基因向L基因的表達，刺激病毒基因組的轉錄過程，來終止宿主細胞蛋白的合成。在感染初期，ICP27抑制宿主細胞RNA的粘接，之后它便能使RNA P-2移到病毒復制位點，幫助病毒RNA完成從胞核到胞質轉移。這對ICP0和ICP4的分布起著決定性的作用，從而能使調節蛋白進入病毒顆粒而發揮作用。

2.4基因組的復制

在病毒復制早期，基因組以雙向或 方式進行復制，產生許多環狀子代DNA，到復制后期，DNA合成轉向滾環復制（ 復制），形成大量首尾相連的線性多拷貝基因組串聯體，這些串聯DNA被稱為“未成熟DNA”，是組裝的最佳底物。復制起始位點結合蛋白（ori-binding protein）具有解旋酶（Helicase）的活性，可以將雙鏈DNA解旋為單鏈DNA。單鏈DNA會結合許多拷貝的單鏈DNA結合蛋白（ssDNA-binding protein）以防重新形成雙螺旋。病毒的ori位點隨后會結合具有解旋酶活性的蛋白復合體以形成一個復制叉。在其中一條鏈上，該復合體會合成一個較短的RNA與該DNA互補，該RNA作為引物在DNA聚合酶的作用下會開始導引鏈的合成。在基因組的另一條單鏈上，DNA以岡崎片段的形式進行合成。

HSV DNA復制所必需的基因產物如DNA聚合酶、DNA結合蛋白、引物合成酶等，都位于UL上（UL 29、UL30、UL40），主要依賴于E蛋白。編碼DNA復制各種酶：UL30、UL42等，此外，解旋酶-引發酶復合體（helicase-primase complex）是HSV復制的關鍵基因，它具有DNA解旋酶、引物酶、單鏈DNA依賴型ATP水解活性和與DNA結合能力的多種功能。這些復制相關酶直接參與病毒DNA復制過程，對病毒的復制產生重要作用。

病毒DNA合成至少需要七種病毒蛋白。其他病毒蛋白，主要是胸苷激酶、核糖核酸還原酶、dUTPase和尿苷酰DNA葡萄糖化酶，控制病毒核酸代謝。TK是一種磷酸轉移酶，主要作用是介導脫氧胸苷進入DNA合成的旁路途徑的一部分。

2.5組裝和釋放

核衣殼的組裝在細胞核中進行，首先組裝成具有外殼和內殼的空心球形原衣殼，然后殼內側的支架蛋白被水解，病毒DNA再進入原衣殼的內在細胞核內，病毒支架蛋白（preVP22a）、門戶蛋白（pUL6）、主衣殼蛋白（VP5）、病毒蛋白酶（UL26）共同組裝成為基本衣殼，VP19C和VP23三聚體再與基本衣殼結合，然后再與六邊形和五邊形衣殼蛋白結合，形成球形原衣殼，其強度主要靠支架蛋白來支撐。在DNA包裝以前或進行過程中，蛋白酶水解支架蛋白使原衣殼外殼構象改變，成為穩定的20面體結構，一條病毒DNA通過一個20面體頂部的一個入口進入原衣殼，成為成熟的病毒核衣殼。UL6蛋白即該入口的主要蛋白。

在成熟核衣殼形成之后，則被囊膜包裹，最后釋放。其釋放過程如下：首先，核衣殼通過出芽方式從被轉運至的核內膜進入到核周間隙，獲得臨時囊膜;然后，有兩種方式可以脫去囊膜。其一，病毒的核衣殼在臨時囊膜與細胞外膜融合后，被釋放到細胞質中，之后再通過高爾基體中形成新囊膜，通過出芽釋放;其二，病毒囊泡進入高爾基體，獲得成熟病毒中的糖蛋白，使富含糖蛋白的病毒顆粒與細胞膜融合，釋放成熟的病毒顆粒。

至少六種病毒蛋白可確保病毒基因的穩定表達，并動員細胞蛋白有效合成病毒DNA和蛋白質。感染后，作為UL41基因的產物，外殼蛋白和細胞蛋白之間彼此互相作用，完成mRNA的即刻降解。另一種外膜蛋白VP16，則能增強 基因的表達。感染的細胞蛋白0、4和22（ICP0，ICP4和ICP22）是多功能病毒蛋白，其改變感染細胞的環境以允許病毒基因的有效高水平表達。 ICP0在細胞核和細胞質中均有表達; 其在泛素-蛋白小體通路中的作用正在研究中。ICP47是另一種多功能蛋白質;阻斷感染初期的RNA剪接，并在感染后期，將病毒mRNA完成從細胞核到細胞質的轉移。調節蛋白ICP0，ICP4和ICP22被細胞激酶（例如，細胞周期蛋白激酶，cdc2）和病毒 - 蛋白激酶（US3和UL13）磷酸化。 UL13使許多病毒和細胞蛋白磷酸化，并且經常成為抗病毒化療的靶點。

3總結

HSV的復制是一個復雜的過程，其間涉及多種病毒基因表達的蛋白調控，共同作用控制。探明病毒的復制機制以及其中涉及的主要調節產物，能對HSV引起的疾病做出有效的防治措施。

*通訊作者：匡琳

作者簡介：胡雅涵，女，本科在讀，研究方向：臨床醫學;通訊作者： 匡琳，女，博士，研究方向：中西醫結合皮膚性病學。

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