高效液相色譜-原子熒光光譜聯用法測定魚肉罐頭中甲基汞的不確定度分析

趙娜娜 袁堃 周賽靜

摘要 采用液相色譜-原子熒光光譜聯用法測定魚肉罐頭中甲基汞含量，通過建立不確定度評估的數學模型，分析不確定度的主要來源，并對各不確定度分量、合成不確定度和擴展不確定度進行計算。結果表明，樣品中甲基汞含量為0.048 mg/kg，其擴展不確定度為0.004 6 mg/kg（k=2），不確定度主要來源是標準曲線擬合、標準溶液配制、測量重復性和提取效率，其中影響不確定度的最大因素是標準曲線擬合，其次是標準溶液配制，樣品稱量對不確定度影響最小。

關鍵詞 高效液相色譜-原子熒光光譜聯用法;甲基汞;不確定度;金槍魚罐頭

Abstract The content of methylmercury in tinned tuna was determined by high performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry （HPLCAFS）.The sources of uncertainty in the measurement process by mathematical modeling were systematically analyzed.The main uncertainty components，combined uncertainty and expanded uncertainty for the determination of methylmercury were calculated.The results showed that when the content of methylmercury in tinned tuna was 0.048 mg/kg，and the extended uncertainty was 0.004 6 mg/kg（k=2）.The major factors which affected the uncertainty came from standard curve fitting，standard solution preparation，sample repeatability tests and extraction efficiency.The most important factor which affected the uncertainty was standard curve fitting，followed by standard solution preparation.The influence of the sample weighing on the uncertainty was the smallest.

Key words High performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry （HPLCAFS）;Methylmercury;Uncertainty;Tinned tuna

汞及其化合物在環境中普遍存在，因其具有的高致毒性、持久性和長距離遷移性等特點，是一種全世界公認的持久性有毒物質（persistent toxic substance，PTS）[1]。食品中的汞主要以無機汞和有機汞的形態存在，其中，有機汞的毒性是無機汞的幾百倍，而在有機汞中甲基汞的毒性最大。無機汞可以通過生物甲基化或者光化學反應等過程轉化為毒性更強的甲基汞[2-7]。甲基汞主要損害中樞神經系統，對胎兒也有明顯的致畸作用。由于環境的污染和生物鏈的富集作用，水產動物及其制品易受甲基汞的污染[8-11]。

筆者以基質復雜的魚肉罐頭為研究對象，采用液相色譜-原子熒光光譜聯用方法測定其甲基汞含量，并依據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[12]對檢測結果進行不確定度評估。該試驗是以日常檢測工作為基礎建立的評定方法，可以真實反映實驗室檢測結果的置信水平，給出結果判定的風險，為檢測結果的科學性提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-原子熒光光譜聯用（中國吉天SA-50）;高速冷凍離心機（美國Thermo公司）;振蕩器（德國IKA）;XPE-205電子天平（中國梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

甲基汞標準溶液：甲基汞溶液（65.0±2.5）μg/g，中國計量科學研究院; 乙腈、乙酸銨為色譜純，鹽酸、氨水為優級純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件。

色譜柱：C18柱（柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm）;流動相：0.06 mol/L乙酸銨 +0.1% L-半胱氨酸+5%乙腈;流速：1.0 mL/min。進樣量：100 μL。

1.2.2 光譜條件。負高壓：280 V;燈電流：30 mA;載氣流速：300 mL/min;屏蔽氣流速：600 mL/min;泵速：65 r/min;載流：7%鹽酸;還原劑：2% KBH4-0.5%KOH混合液;氧化劑：0.2%K2S2O8-0.5%KOH混合液。

1.3 檢驗方法 依據國家標準GB 5009.17—2014 《食品中總汞及有機汞的測定》[13]第二篇食品中甲基汞的測定。

1.3.1 樣品前處理。

準確稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于高速離心管中，加入鹽酸溶液（5 mol/L）10 mL，渦旋混勻，放置過夜。室溫下超聲水浴提取60 min，期間振搖數次，離心15 min（4 ℃，8 000 r/min）。準確吸取2.0 mL上清液至5 mL 容量瓶中，緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液（6 mol/L）調節樣液pH為2～7。加入0.1 mL的L-半胱氨酸溶液（10 g/L），用水定容至刻度。經0.22 μm有機濾膜過濾后上機測定。按同一操作方法作空白試驗。

1.3.2 標準溶液的配制。

稱取甲基汞溶液0.769 2 g于50 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，搖勻，得濃度為1.0 μg/mL的甲基汞標準儲備溶液。用100～1 000 μL移液槍移取1.00 mL 儲備液至10 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，得濃度為100 ng/mL的甲基汞標準中間液。分別移取 0、100、200、400、600、1 000 μL的甲基汞標準中間液（100 ng/mL）至10 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，得到濃度分別為0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 ng/mL的標準工作液。

1.3.3 數學模型的建立。金槍魚罐頭中甲基汞含量計算公式如下：

式中，X為樣品中甲基汞的含量（mg/kg）;C0為空白溶液中甲基汞濃度（ng/mL）;C為試樣溶液中甲基汞濃度（ng/mL）;V為試樣提取液體積（mL）;m為試樣質量（g）;1 000為換算系數;frec為回收率校正因子。

2 不確定度的分析

根據測量過程和數學模型分析，影響魚肉罐頭中甲基汞含量結果不確定度的因素主要包括稱樣量、樣品前處理、標準溶液配制、樣品測定重復性、回收率。

2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度Urel（m） 樣品的稱樣量為m=1.0 g，天平的最大允許誤差為±0.1 mg，為B類評定，按矩形分布，k=3，則其標準不確定度為：U1（m）=a/k=0.000 057 7。由于樣品稱量包括空杯清零和實際樣品稱量2次操作，計算稱量2次的標準不確定度為：U（m）=U20（m）+U21（m）=0.000 081 6，相對標準不確定度為：Urel（m）=U（m）/m=0.000 081 6。

2.2 樣品定容體積引入的相對標準不確定度Urel（V） 樣品提取過程中用到了10 mL移液器（加鹽酸10 mL）、5 mL移液器（吸取2.0 mL上清液）和5 mL容量瓶（定容），分別計算其不確定度。

依據JJG 646—2006《移液器檢定規程》[14]，10 mL移液器的最大允許誤差為0.6%，5 mL移液器的最大允許誤差為0.5%，按矩形分布，k=3，則其相對標準不確定度分別為：Urel（V10 mL）=0.6%3=0.003 46、Urel（V5 mL）=0.5%3=0.002 89。

樣品處理完成后定容至5 mL容量瓶中，不確定度主要來源包括：①容量瓶最大允許誤差引入的不確定度Urel（V1′），依據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[15]，A級5 mL容量瓶的最大允許誤差為±0.020 mL，按三角分布，k=6，相對標準不確定度為：Urel（V1′）=0.0206×5=0.001 63;②溫度誤差引入的不確定度Urel（T1′），實驗室溫度變化范圍為（20±5）℃，水在20 ℃的膨脹系數為α=2.1×10-4℃-1，由溫度變化引起溶劑體積改變的標準不確定度為：U（T1′）=ΔV/k=（V×ΔT×α）/k，相對標準不確定度為Urel（T1′）=0.000 606。5 mL 容量瓶的合成相對不確定度為Urel（V5 mL）=U2rel（V1′）+U2rel（T1′）=0.001 74。樣品定容體積引入的相對標準不確定度為：Urel（V′）=U2rel（V10 mL）+U2rel（V5 mL）+U2rel（V5 mL′）=0.004 83。

2.3 甲基汞標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度Urel（C）

2.3.1 標準物質含量的相對標準不確定度Urel（CS）。甲基汞溶液標準物質為中國計量科學研究院提供，甲基汞含量為65.0 μg/g，其擴展不確定度為2.5 μg/g，k=2，標準物質的稱量引入的相對標準不確定度為：Urel（Cs）=2.565.0×2=0.019 2。

2.3.2 標準物質的稱量引入的相對標準不確定度Urel（m1）。標準物質稱樣量為0.769 2 g，天平的最大允許誤差為±0.1 mg，按矩形分布處理，k=3，則標準物質在2次稱量過程（清零和實際稱量）中產生的相對標準不確定度：Urel（m1）=0.000 1×23×0.769 2=0.000 106。

2.3.3 標準溶液稀釋過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度Urel（VC）。

該項不確定度主要來源包括量器最大允許誤差引入的不確定度Urel（V）、溫度誤差引入的不確定度Urel （T）。實驗室溫度變化范圍為（20±5）℃，水在20 ℃的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1。標準溶液稀釋過程中玻璃量器和移液器容量最大允許誤差引入的不確定度見表1，溫度誤差引入的不確定度見表2，各量器相對標準不確定度見表3。

綜上所述，甲基汞標準溶液配制過程中引入的合成相對標準不確度：Urel（C）=U2rel（CS）+U2rel（m1）+U2rel（VC）=0.026 9。

2.4 標準曲線擬合過程的相對標準不確定度Urel（Cstd）

利用液相色譜-原子熒光光譜聯用儀對濃度分別為1、2、4、6、10 μg/L 的甲基汞標準工作液進行峰面積的測定，每個濃度點測定2 次，采用線性最小二乘法擬合標準工作曲線，結果詳見表4。同時對魚罐頭樣品在進行6次重復測定，根據如下公式對標準曲線擬合過程中引入的不確定度進行計算：

式中，b為標準曲線斜率，p 為測定樣液的測定次數， p=6;m為每個濃度點的測定次數，m=2;n為標準溶液濃度點的總數， n=5;

C0為樣品中甲基汞的質量濃度的平均值，C0=1.85 μg/L;Cij為標準溶液各校準點的濃度;C為標準曲線中校準點Cij的質量濃度平均值;Sij為各質量濃度點測定的峰面積;Si為由標準曲線計算得到的各質量濃度點的峰面積。根據表4的數據計算S（S）=2 282、SC=102.4、U（Cstd）=0.060 7、Urel（Cstd）=U（Cstd）C0=0.032 8。

2.5 測量重復性引入的相對標準不確定度Urel（Rep） 在重復性條件下，對魚肉罐頭中甲基汞的含量進行了6次獨立試驗（n=6），所得測量數據見表5。由表5計算魚肉罐頭中甲基汞含量的平均值為=0.044 1 mg/kg，標準偏差為S=0.001 86，由測量重復性引入的相對標準不確定度：Urel（Rep）=sn×=0.017 2。

2.6 提取效率引入的相對標準不確定度Urel（Rec）

由于樣品提取不完全或提取過程中導致甲基汞的損失等，使魚肉罐頭中的甲基汞不能100%進入到測定液中，因此，該試驗在試樣中添加3組不同含量的甲基汞標準溶液（0.05、0.10、0.15 mg/kg），考察回收率對不確定度的影響，即用回收率平均值的標準偏差評估樣品提取效率引入的標準不確定度。同時根據t檢驗判斷平均回收率與100%是否有顯著性差異。

經計算，甲基汞的平均回收率為Rec=91.3%，標準偏差S（Rec）=3.13%。查t檢驗臨界值分布表JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[12]，t（95，n-1）=t（95，8）=2.31，該試驗中t值8.34大于t（95，8），因此，該試驗的回收率與100%有顯著性差異，必須在計算結果的公式中乘以回收率校正因子（frec=1Rec）對結果進行修正，最后得出Urel（Rec）=S（Rec）Rec×n=0.011 4。

2.7 合成不確定度 將各不確定度分量來源及量值列于表6。

從表6可以看出，對測定結果影響較大的不確定度來源是標準溶液配制、標準曲線擬合、測量重復性和提取效率，樣品稱量和定容引入的相對不確定度較小。各不確定度分量相互獨立，因此，合成相對不確定度為：

合成標準不確定度：U（X）=Urel（X）×X=0.002 3（X為表5的樣品測定濃度按照甲基汞計算公式得到的平均值）。依據JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[16]，在0.05的置信水平下，取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×U（X）=0.004 6。魚肉罐頭中甲基汞的測定結果：X=（0.048 0±0.004 6）mg/kg，k=2。

3 結論

該研究采用液相色譜-原子熒光光譜聯用法測定魚肉罐頭中的甲基汞，對測定過程中不確定度的主要來源及各不確定分量進行評定。結果表明，不確定度主要來源是標準溶液配制、標準曲線擬合、測量重復性和提取效率，其中影響不確定度的最大因素是標準曲線擬合，其次是標準溶液配制，樣品稱量和定容對不確定度影響較小。

因此，在今后的檢測過程中，重點監控標準曲線帶來的不確定度，通過選擇高純度的標準品和高精度的量器、增加測量次數、提高檢驗人員的操作水平、注意儀器的維護保養使其保持較高靈敏度等措施減少測量數據的不確定性，保證檢測結果的準確性。

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