Argonaute蛋白結構及其在植物中的研究進展

摘要：在真核細胞中，許多小的非編碼RNA與Argonaute蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體，并通過識別互補的靶標RNA來調控基因表達，此過程叫RNA干擾。在植物的RNA干擾途徑中，Argonaute-sRNA復合物可以通過多種不同的機制發揮作用，進而參與病原體防御、植物發育調控等關鍵的生物過程。綜述了Argonaute蛋白的分類和結構特征、在植物體中參與RNA干擾的機制及生物學功能等研究進展。

關鍵詞：Argonaute蛋白;結構;RNA干擾;功能

中圖分類號：Q51

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 08-0011-06

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.08.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

小的非編碼RNA是原核生物和真核生物中基因表達控制的重要參與者。在真核生物中，幾類小的非編碼RNA通過特異性識別互補的靶標RNA來調節基因表達，并保護細胞免受外源性和內源性有害遺傳物質的影響。Argonaute蛋白是RNA誘導沉默復合體（ RISC）的核心蛋白，是表觀遺傳調控的主要參與者，在RNAi中通過剪切靶向mRNA、翻譯抑制、DNA甲基化等方式發揮作用。本研究綜述了Argonaute蛋白的分類和結構特征、在植物體中參與RNA干擾的機制及生物學功能等研究進展，旨在為后期研究提供基礎。

1 Argonaute蛋白的分類和結構特征

Argonaute蛋白在擬南芥突變體的研究中被首次提及[1]，后來發現該蛋白是真核生物中RNA干擾（ RNA interference，RNAi）途徑的關鍵參與者。最近對原核生物基因組分析的結果顯示，Argonaute蛋白同時也存在于古細菌（約30%）和細菌（約10%）中[2.3]。

1.1 Argonaute蛋白的分類

Argonaute蛋白在各種生物中廣泛存在，而且在不同的物種之間存在較高同源性，這表明它們在進化過程中具有古老的起源和高度保守性[2]。基于結構特征和作用機制，所有真核Argonaute蛋白可分為3個主要的進化枝，AGO、PIWI（ P-element in-duced wimpy testis）、WAGO （Worm-specific Argo-nautes）。AGO進化枝蛋白可與microRNA（ miRNA）或siRNA（ small interfering RNA）結合誘導特異性的RNAi;PIWI進化枝蛋白僅發現于動物中，并通過piRNA（ piwi-interacting RNA）調節轉座子的活性[4];WAGO進化枝蛋白特異存在于線蟲，如秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditi_s elegans）。

在進化過程中，Argonaute基因的數量和功能的多樣化均有增加的趨勢，尤其是開花植物所屬的AGO進化枝。如人類中有4種AGO和4種PIWI，果蠅中有2種AGO和3種PIWI，而擬南芥（Arabi-dopsis中有10種ACO，楊樹中有15種、玉米中有17種、水稻中有19種[5]。迄今為止，植物中發現的Argonaute蛋白均屬于AGO進化枝。開花植物中AGO可分為3個主要分類：AG01/5/10、AG02/3/7和AG04/6/8/9。此外，禾本科植物中的AG018被劃分人AG01/5/10進化枝中[6]。但也有一些真核生物中不存在Argonaute蛋白，如釀酒酵母（Saccharo-mVces cerevLsrae），這可能是RNA干擾系統二次損失的結果[7]。

1.2 Argonaute蛋白的結構特征

Argonaute蛋白屬于PIWI蛋白超家族，其由PI-WI結構域的存在來定義。真核Argonaute蛋白在結構上是非常保守的，包括N末端、PAZ（ PIWI-Ar-gonaute-Zwille）、MID（ Middle）和PIWI 4個結構域，其由N末端、MID和PIWI 3個結構域形成新月形的底部凹槽，PAZ結構域位于凹槽正上方（圖1）。其中，N端和PAZ結構域通過L1 （Linker l）連接，PAZ和MID結構域通過L2（Linker 2）連接，核酸結合在由N-PAZ和MID-PIWI形成的雙葉通道中[8]。Argonaute蛋白的活性中心位于具有核糖核酸酶H（ Ribonuclease H，RNase H）的PIWI結構域，其催化中心的氨基酸四聯體Asp-Clu-Asp-His/Asp（ DEDH/D）可以與金屬離子配位，并且是RNA切割所必需的[9，10]。MID結構域含有容納RNA指導鏈5 7末端核苷酸的口袋[11]，PAZ是RNA指導鏈3'末端核苷酸的結合域，N端結構域參與RNA雙鏈體的解旋并在RNA切割過程中起輔助作用[12，13]。迄今為止，已確定三維結構的真核Argonaute蛋白包括KpAgo，Human Agol、2、3及PIWI進化枝的SIWIll41（圖IA、B均以Human Ag02為例，PDB為4W5N）。

原核Argonaute（ pAgo）蛋白可分為2個大的系統發育組[15，16]。長pAgo含有與真核Argonaute（ eA-go）蛋白相同的結構域（但AfAgo等缺失N-PAZ結構域），而短pAgo僅含有MID和PIWI結構域。目前，研究的真核Argonaute蛋白和長pAgo都有雙葉結構，這些含有完整四分體的Argonaute蛋白一般都具有切割活性，但許多pAgo（含所有短pAgos）因存在必需催化殘基取代而缺乏核酸內切酶活性。

2 植物Argonaute蛋白與RNAi途徑

2.1 RNA誘導的沉默復合體

與真核Argonaute蛋白結合的小RNA包括miRNA、siRNA和piRNA。其中，miRNA和siRNA都需要經歷核糖核酸內切酶Dicer的處理，但miR-NA必須首先被核酸內切酶Drosha加工成miRNA前體（precursor miRNA，pre-miRNA）[17]。之后成熟的RNA雙鏈體結合到Argonaute蛋白上，并伴隨著RNA雙鏈的展開和siRNA、miRNA乘客鏈的解離，而siRNA、miRNA則通過糖一磷酸主鏈與Argonaute蛋白保持結合狀態，形成RNA誘導的沉默復合體（ RNA-induced silencing complex， RISC）[18].piRNA發現于后生動物中，它可以是單鏈且不依賴于Dicer和Drosha的切割[19]。與miRNA和siRNA不同，piRNA僅與PIWI進化枝蛋白結合，發揮對宿主基因表達、轉座子抑制或抗病毒感染的調節作用[20]。

2.2 Argonaute在RNAi途徑中的機制研究

植物中，Argonaute-sRNA復合物通過轉錄后基因沉默（ Post-transcriptional gene silencing，PTCS）或轉錄基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）的方式靶向互補DNA或RNA，從而在2個水平上影響基因表達：①轉錄后水平，在細胞質中，通過對靶標mRNA切割或抑制其翻譯[21];②轉錄水平，在細胞核中，調節組蛋白或靶標DNA的甲基化[22，23]。此外，擬南芥中的AG01-miRNA與miR161和miR173基因座處的染色質相互作用，在鹽脅迫條件下對miRNA基因進行轉錄調控[24];AC02還可以參與DNA雙鏈斷裂修復[25]。

2.2.1 轉錄后基因沉默水平上的機制 在植物RNAi途徑的轉錄后基因沉默水平上，Argo-naute-sRNA復合物與靶標mRNA結合后可能發生靶標RNA切割或翻譯抑制。靶標RNA切割是siR-NA發揮作用的主要機制（圖2A），而miRNA-RNA雙鏈體只有在完全互補時才會發生靶標RNA切割[26]。因此，sRNA-RNA雙鏈體中的鏈互補性在RNAi途徑的機制選擇中起重要作用。研究表明，擬南芥中AG01、AG02和AG07的剪切活性分別對植物發育、抗病毒活性和幼年至成年期轉變的過程至關重要[27]。對野生型和AG01剪切活性缺失的擬南芥進行分析，發現AC01的剪切活性對反式作用干擾小RNA（ trans-acting siRNA，tasiRNA）也十分重要[28]。

Argonaute-miRNA復合物在無法進行靶向切割的情況下，可以選擇通過翻譯抑制的方式調節基因的表達，這個過程通常伴隨著mRNA降解以抑制復合物形成[29.30]。目前，尚不清楚翻譯抑制是從哪一步發生的（翻譯起始或延伸），但研究顯示翻譯起始可能是Argonaute-miRNA復合物發揮作用的主要位點（圖2B、C）[31]。一種可能的機制是Argo-naute-miRNA復合物與elF4F的結合阻止了翻譯起始復合物的組裝[32];此外，miRNA-Argonautes復合物還可以募集GW182蛋白到靶標RNA 3非翻譯區，結合多聚腺苷酸結合蛋白（poly A-binding pro-tein，PABP）抑制翻譯起始，并且mRNA對去腺苷酸化也變得更敏感（圖2D）[33]。研究表明，幾種擬南芥突變體在miRNA介導的RNAi途徑中出現了蛋白質而非mRNA水平的受損[34.35]：AG010（AG01進化枝的另一成員）也具有翻譯抑制幾種擬南芥miRNA靶基因的能力。最近，Hou等[36]發現AG07-iR390與miR390靶位點的結合導致了核糖體堆積并隨后抑制翻譯的延伸。目前，對翻譯抑制的機制已有一些初步研究，但深入理解仍需要進一步研究。

2.2.2轉錄基因沉默水平上的機制 小RNA介導的轉錄沉默首先在裂殖酵母（ Schizosaccharomycespombe）中被發現[37]。2017年，Jih等[38]發現H3K9me3是H3K9me結構域通過募集Clr4到異位點后建立表觀遺傳所必需的。因此，組蛋白的H3K9me狀態不僅決定異染色質內的沉默機制，還決定其潛在的表觀遺傳性。

另外一種實現RNA干擾途徑的機制為RNA介導的DNA甲基化（RdDM），最典型的是植物中的AG04-siRNA復合物[23]。它首先是由PolIV （RNA聚合酶IV）和RDR2（RNA依賴性RNA聚合酶2）的協同作用合成雙鏈RNA[39]，之后在核酸酶DCL3（Dicer like protein 3）的作用下將前體dsRNA切割成24 nt siRNA，然后將siRNA轉運到細胞質與AC04結合[40]。AG04-iRNA復合物定位到細胞核后，通過與PolV轉錄物配對被募集到靶基因座，同時AG04-siRNA復合物募集DRM2蛋白使靶DNA甲基化（圖2E）[41]。因此，RNA介導的DNA甲基化在真核細胞的遺傳調節中起重要作用。最近，研究者提出AG06可同時與AG04介導大多數靶基因座的甲基化[42]。此外，AG06還可與RDR6介導的21-22 nt sRNA結合來指導擬南芥中轉運子的甲基化[43]。

所有真核生物都含有小的非編碼RNA和Argo-naute蛋白，參與mRNA轉錄和翻譯的調控，控制移動遺傳元件的活性，并參與染色質重組。而事實上，真核Argonaute只是原核Argonaute蛋白上形成的一個小分支，所以原核Argonaute實際上比真核Ar-gonaute在功能上更加多樣化[2，44]。近年來，對原核Argonaute蛋白的結構和生化研究，特別是關于嗜熱古細菌中Argonaute的研究揭示了引導鏈結合、靶標識別和剪切活性的詳細途徑，這為真核生物中RNAi的分子機制提供了重要的見解。

3 Argonaute在植物中的生物學作用

3.1 植物Argonaute與病原體防御

微生物病原體會導致作物嚴重的產量損失，由sRNA介導的RNA干擾（RNAi）在植物抗病毒防御的免疫應答中起關鍵作用[4副，Argonaute蛋白的功能障礙與許多動物和植物疾病有關[46]。在抗病毒中起作用的AGO進化枝蛋白包括擬南芥AG01、AG02、AG04、AC05、AC07和AG010，本生煙草（Nicoti-aha bentharniana）AC01和AG02以及水稻AGOI和AG018。如vsiRNA（病毒來源的RNA或dsRNA被植物DCL加工成病毒衍生的21-24 nt siRNA）與特異性Argonaute結合后，通過剪切或翻譯抑制等方式增強抗病毒防御，從而靶向和抑制同源病毒RNA[47];此外，植物AGO還可以結合來自類病毒的sRNA減少體內類病毒的積累[48]。研究表明，擬南芥AG04獨立于其RdDM功能，而對車前草花葉病毒（Ptantago asiatica mosarc VLrus）具有直接的抗病毒活性[49]。除了眾所周知的抗病毒防御作用外，幾種擬南芥AGO還具有抗菌活性，如AG02結合miR393b翻譯抑制高爾基體定位的MEMB12基因，導致具有高抗菌活性PRl（ Pathogenesis-related pro-tein）的胞吐作用[50]。

3.2 植物Argonaute在調控發育中的作用

在擬南芥中，首次被表征的AG01突變體使其表現出矮化、不育等發育缺陷[1]。之后，在擬南芥的發育篩選中鑒定出一系列造成發育缺陷的AC01等位基因，這些突變體的鑒定強調了AG01在葉極性和側生器官發育中的作用，同時AC01突變體也在水稻上顯示出侏儒癥、卷葉和低結實率等發育缺陷特征51.52]。而擬南芥突變體AC07或AG010只顯示出有限的影響發育缺陷的能力。其中，AG07與miR390結合后，靶向TAS3轉錄物并啟動基于TAS3的tasiRNA合成，參與擬南芥側生器官發育的調節;AG07參與苔蘚、水稻和玉米等植物中TAS3介導的tasiRNA合成，這表明植物中AG07在ta-siRNA合成和植物發育中具有重要作用[50]。與普遍表達的AG01不同，AG010主要在近軸面葉原基和分生組織中表達，其突變體使擬南芥表現出異常的SAM發育，且觀察結果表明，AG010可以從AG01中螯合miR165huiR166來調節SAM發育[53，54]。

3.3 植物Argonaute在減數分裂和配子發生中的作用

植物AGO在有性生殖過程中起關鍵作用，特異性的ACO蛋白優先表達于生殖組織并富含于生殖細胞中b副。在水稻中，減數分裂調控基因MEL1（Meiosis arrested at leptotene J）是5種AG05同源物之一，它的突變不僅誘導了減數分裂停滯和雄性不育，還誘導了異常的絨氈層和花粉母細胞[56]。在擬南芥中的研究表明[57]，AG09介導的轉座子和異染色質修飾對于其子房中特異性細胞的生存至關重要，它的突變導致了多個具有形成配子能力的細胞分化;在玉米中，AG09突變體在減數分裂期間阻止了染色體的分離。擬南芥和玉米AG09都在體細胞中起作用以非細胞自主方式調節細胞，擬南芥AC09抑制體細胞中的生殖細胞[57]，而玉米AC09抑制生殖細胞中的體細胞[58]。在水稻中，OsAC02在花藥中高表達并參與調節水稻花藥的發育。Zheng等[59]發現在OsAG02表達下調的水稻中，己糖激酶l（OsHXKl）的過度表達導致ROS的過度積累，并誘導了過早的絨氈層程序性細胞死亡（PCD）和花粉敗育。

4 小結

除上述內容外，植物中的AGO蛋白也可在非生物或生物脅迫下誘導產生。如水稻AG018積累是病毒感染誘導的結果;AG02是γ輻射、細菌感染誘導的結果;AG03是鹽脅迫誘導的結果。不同AGO成員在時空上的差異及某些AGO對應激的反應表明存在一些調節AGO轉錄的因子，如擬南芥AG010的表達被轉錄因子LBD12-1抑制。但目前關于植物中AGO蛋白的轉錄調節因子尚不清楚。盡管已經對植物AGO有了較多的研究，但在未來的研究中需致力于發現其新的生物學功能。如AGO-sRNA復合物的靶標RNA在植物中是否高度保守，AGO蛋白中是否存在其他結合位點可以對小分子RNA進行特異性結合，互補程度少于多少才會使AGO-miRNA執行翻譯抑制，不同的sRNA如何對AGO蛋白進行選擇，植物中是否存在PIWI進化枝蛋白及piRNA等。其次，目前并未獲得植物中AGO-sRNA復合物的晶體結構，而對晶體結構的研究有利于研究者掌握引導鏈結合、靶標識別和參與RNAi的機制，這將為真核生物中RNAi的分子機制和各種生物學功能的研究提供見解。

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作者簡介：谷少偉（1993-），女，河北石家莊人，在讀碩士研究生，研究方向為結構生物學，（電話）13716765867（電子信箱）ladiosa9310@163.com。