質譜技術在植物蛋白質組學研究中的應用

摘要：植物蛋白質組是植物生理特征的動態反映，在植物生長發育、組織器官分化、抵御外界干擾等生理病理過程中發揮著重要作用。綜述了基于質譜技術的植物不同器官、不同發育階段、響應生物及非生物脅迫過程中的蛋白質組學研究進展，以期對后續植物蛋白質組學的研究提供思路設計和試驗方法上的參考。

關鍵詞：植物蛋白質組;質譜;生長發育;脅迫響應

中圖分類號：Q94

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 08-0005-06

D01：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.08.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

鑒定蛋白質的結構和功能已經成為植物科學的重要研究內容。對蛋白質氨基酸序列的研究在蛋白質、多肽與其編碼基因研究之間搭建了橋梁，更是研究植物蛋白質生理功能及其基因調控間關系的重要紐帶。對蛋白質的研究，使研究者可以更好地了解植物細胞內復雜的調控網絡與作用機制，更全面地認識不同的生物學過程。近年來，隨著質譜技術（Mass Spectrometry，MS）的不斷發展，質譜檢測的靈敏度和準確度不斷提高，質譜法逐漸取代Edman降解等傳統方法，成為蛋白質組學研究的主要手段。

1 基于質譜技術的蛋白質組學概念及常用手段

蛋白質作為生物體不同生物學功能的物質承擔者，其結構和生物學特性一直以來都是生物領域的熱點問題。1996年，Wilkins等[1]提出并使用蛋白質組學（ Proteomics） 一詞，它是“protein”及“genome”2個詞的結合，指的是對某一特定階段的某種細胞或者組織器官中所有蛋白質進行檢測與研究，包括其表達特征、分布特征、相互作用特征、翻譯后修飾特征等。人類含有20 235個基因，對應超過100 000個蛋白質，可見蛋白質組學研究具有高度復雜性及較大的動態范圍。不同蛋白質間的數量、分子量及親疏水性上的差別，加大了蛋白質組學的研究難度[2]。蛋白質組學是表征基因功能最好的方式，基因表達水平的波動可以被蛋白質組學動態地反映出來。

在植物蛋白質組學研究中最常用的策略是自下而上質譜鑒定方法的鳥槍法研究策略。自下而上的研究策略將蛋白質樣品進行酶切，酶切后的肽段進行質譜分析，通過將鑒定到的碎片離子進行拼接得到的序列信息與蛋白質數據庫的理論酶切結果進行比較，確定待測蛋白質樣品的氨基酸序列。鳥槍法的優勢在于肽段易于利用色譜等方法進行預分離，分離后的樣品易溶解在水溶液中，在高溫環境中氣化而轉化為噴霧狀，繼而在外加電場的影響下形成帶電離子傳人質譜，在較為簡單的碎裂條件下形成碎片離子而被質譜儀檢測到。鳥槍法利用肽段的定性、定量信息來反映蛋白質的結構及表達量，基于這種思路，多種定量分析方法也被開發出來，例如ICAT[3]、TMT[4]、iTRAQ[5]、DiLeu[6]等，如圖1所示。

在利用鳥槍法進行蛋白質質譜檢測前，常用一定的方法對復雜體系的蛋白質樣品進行預分離，以達到更好的鑒定效果。預分離方法主要分為2類，基于液相的蛋白質分離與純化技術和基于凝膠電泳的分離與純化技術。基于液相的蛋白質分離與純化主要是利用不同蛋白質分子的物理、化學性質的不同而實現彼此間的分離，如離子交換色譜（ Ion Ex-change Chromatography，IEC）[7]、排阻色譜（Size Ex-clusion Chromatography.SEC）[8]、親和色譜法（Affini-ty Chromatography， AC）[9]等。

基于凝膠的預分離方法主要是依據蛋白質分子量的不同或者分子量及等電點的不同，將蛋白質在凝膠中分離開來，主要包括十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecvl Sulfate-Polyacryl-amide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）[10]、雙向凝膠電泳（Two-dimensional Gel Electrophoresis， 2D-Gel）[11]和二維熒光差異凝膠電泳（Two-dimensional Differ-entialGel Electrophoresis，2D-DIGE）[12]。基于凝膠的分離方法，尤其是2D-Gel作為一項成熟的技術已經在蛋白質組學領域應用超過30年。

2 植物組織或細胞器的蛋白質組學分析

2.1 不同器官的蛋白質組學分析

根、葉和果實等作為植物體的重要器官，其蛋白質組得到了廣泛的研究。植物的根系在植物生物量中占有很大比重，在植物的水及營養吸收、植物在土壤中的固定及植物對地下環境的感知中發揮著重要作用。Petricka等[13]利用蛋白質組學方法，分離出6種擬南芥根細胞，包括根毛細胞、非根毛表皮細胞、皮質細胞、內胚層細胞、脈管系統細胞和小柱細胞，并對這6種細胞的蛋白質組進行了質譜檢測。對鑒定的蛋白質進行分析，發現有超過1/3的蛋白質特異性地在單一類型細胞中表達，其中238個蛋白質僅在根毛中表達，其功能與細胞尖端生長、肽基一脯氨酸羥基化、糖基轉移和輔酶Q的生物合成相關。對根毛及非根毛表皮蛋白質組及轉錄組進行分析，Lan等[14]在含有pEXP7-GFP報告結構的擬南芥植物根部共鑒定到23 034個基因及2 447個高可信蛋白質，其中129個蛋白質在根毛及非根毛組織中差異表達。同時，Lan等L141發現轉錄產物與蛋白質的豐度并不總是完全對應的，這表明細胞分化過程受到諸多因素調控，包括轉錄水平、翻譯水平、蛋白質的翻譯后修飾等，這些因素所產生的影響并不均等。

Martin等[15]利用寬粒子選擇監控數據非依賴型非標定量方法（ label-free Wide Selected-Ion Monitor-ing Data-Independent Acquisition， WiSIM-DIA）.建立了包含來自2 338個番茄果實蛋白質的11 753條特有肽段庫，對角質缺陷2基因型（CUTIN DEFI-CIENT2，CD2）番茄與M82基因野生型番茄進行蛋白質組定量研究。共鑒定到1 140個番茄蛋白質，其中67個蛋白質在2種基因型番茄中存在表達差異，差異表達的蛋白質參與表皮素的生物合成。試驗證實，CD2蛋白質影響細胞壁的合成、花青素的合成、植物生長并參與壓力應答。類似地，Mata等[16]利用超速離心、凝膠分離、膠內酶解及高pH反相色譜分離等技術，提取并分離番茄表皮全蛋白質，繼而利用Thermofisher Scientific Q Exactive質譜儀與AB Sciex Triple-TOF 6600質譜儀對其進行分析，共鑒定到8 588個蛋白質。

葉片組織是綠色植物光合作用的主要場所，受到真菌感染的葉片易發生壞死，而導致嚴重的作物損失。Zhang等[17]利用iTRAQ標記對交鏈孢菌感染后的茉莉酸不敏感型番茄葉片及野生型葉片進行定量蛋白質組學分析，共鑒定到10 367個蛋白質，其中有2 670個蛋白質存在差異表達。Aryal等[18]利用排阻色譜法對擬南芥葉片的胞質蛋白質進行了分離，鑒定到上百個以穩定復合體形態存在的蛋白質。

2.2 不同細胞器的蛋白質組學分析

隨著植物蛋白質組學技術的不斷發展及科學探索的不斷深入，對植物的蛋白質組研究已經由細胞水平轉入亞細胞水平，多種重要細胞器內的蛋白質分布特點得到了詳盡描述。葉綠體在細胞代謝中處于中心地位，不僅為細胞提供能量和代謝中間產物，還在某些輔酶、輔酶因子及脂類的生物合成最終步驟中發揮催化作用[18]。借助SDS-PACE電泳技術，Salvato等[19]將提取的馬鈴薯塊莖線粒體全蛋白質進行分離，分離后的蛋白質條帶經膠內酶解后通過LTQ Orbitrap XL進行質譜檢測。利用4種搜庫軟件，在馬鈴薯塊莖線粒體中共鑒定到1 060個非冗余蛋白質，其表達量的動態范圍高達1 800倍，廣泛參與細胞電子傳遞鏈的組成、三羧酸循環過程及蛋白質運輸結構的組成。此外，這些蛋白質中超過50%的蛋白質發生了一種以上翻譯后修飾，最常見的為氧化修飾。

葉綠體作為植物細胞所特有的能量細胞器，是一系列代謝途徑的集合，包含多個蛋白質復合體機器，包括光合系統I和光合系統Ⅱ、細胞色素b6f復合體和ATP合成酶等[20，21]。此外，葉綠體也是必需氨基酸、脂肪酸和維生素合成的場所。因此，葉綠體蛋白質表達特點一直以來都是植物學家關注的熱點問題。Lande等[22]利用Percoll梯度過濾法從鷹嘴豆中分離葉綠體，并用丙酮及尿素提取葉綠體蛋白質，SDS-PAGE電泳分離及酶切后進行質譜檢測，共鑒定到2 451個蛋白質，包括27個異構體。類似地，利用差異蛋白質組學方法，Uberegui等[23]以光對葉綠體蛋白質的影響為研究對象，檢測到幾種光合作用及碳代謝相關蛋白質以及胞質mRNA加工相關蛋白質的豐度變化，提示執行蛋白質（Executer pro-teins）在光照條件下參與擬南芥的信號傳導，參與調控葉綠體代謝及植物對環境變化的響應。

高爾基體在植物細胞壁基質多糖合成、蛋白質糖基化及囊泡轉運過程中發揮著重要作用，Parsons等[24]利用密度梯度離心及表面電荷分離技術，從擬南芥中分離出高爾基體膜，利用質譜定量技術共鑒定出371個高爾基體蛋白質，其中包含參與細胞壁合成的重要蛋白質。

3 植物脅迫相關蛋白質組學分析

3.1 生物脅迫

植物的生物脅迫是指植物在生長發育過程中，由于其固著生長的特點，容易受到一些生物體來源的環境脅迫，如病原體感染（包括真菌、細菌、病毒、線蟲）[25]、寄生植物干擾、害蟲干擾等，植物通過多種生理、生化、細胞和分子水平的變化來抵抗這些脅迫效力。宿主植物主要通過2種方式來抵御病原體等生物脅迫，即組成型抵抗和誘導型抵抗。植物組成型抵抗主要依賴于形態學特征的改變和次生代謝產物的合成，包括細胞壁成分（如木質素、角質和蠟質）、氣孔結構、低分子量抗真菌化合物、可以與真菌幾丁質結合的凝集素以及核糖體失活蛋白質等[26]。對宿主植物抵抗真菌感染的研究是目前最為深入的，真菌種類包括鐮刀菌（Fusarium）、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、炭疽病病原體（AnthracnosePathogens）、大豆銹病菌（Uromyces Appendiculatus）、甘藍鏈格孢（Alternaria Brassicicola）及葡萄孢菌（Botr-ytis Cinerea）等。Asano等[27]將鐮孢鐮刀菌和禾本科鐮刀菌接種到擬南芥花與葉片上，通過比較蛋白質組學的方法并結合MALDI-TOF/TOF儀器的使用，鑒定到與病原體感染發病相關的顯著上調蛋白質，其中谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）作為上調蛋白質被首次發現。GST蛋白質是防御反應蛋白質超家族的一員，在生物體對病原體的應激反應中發揮生理功能。

炭疽病在世界范圍內都有發生，尤其是在熱帶和亞熱帶濕熱地區，這些地帶更適合炭疽病病原菌的生長。Fang等[28]利用二維凝膠電泳技術對感染炭疽病菌24、48和72 h后的草莓葉片蛋白質進行分離，并用MALDI-TOF/TOF 4800質譜儀對樣品進行差異蛋白質鑒定，共檢測到49個差異蛋白質，廣泛參與代謝過程、光合作用、能量產生過程，具備抗氧化活性;同時，在參與代謝途徑的蛋白質水平上觀察到許多變化，包括卡爾文循環、磷酸戊糖途徑及糖酵解途徑，這些發現為探究非模式生物中的病原體抵抗機制提供了參考。

大多數植物病原細菌是桿狀細菌，包括假單胞菌屬、黃單胞菌屬、歐文氏菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬和根瘤菌屬[26]。Parker等[29]以Rio Grande番茄（RG）的2個基因同源品種，即表達Pto基因而與細菌不相容的RC-PtoR以及缺失Prf3基因而具有易感表型的RC-prf3，進行iTRAQ定量，以探究不同時間點蛋白質組的變化對植物抵抗病原體能力的影響。根瘤菌可以通過與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣從而為植物體提供營養，在農業生產中具有重要作用。Nguyen等[30]采用iTRAQ試劑盒標記根瘤菌感染及未感染的大豆根毛和脫落根全蛋白質，借助Ni-NTA磁珠進行磷酸化蛋白質富集，磷酸化蛋白質組在LTQ Orbitrap Velos質譜儀中進行分析。在2種大豆根毛及脫落根中共鑒定到1 625個磷酸化肽段上1 659個磷酸化位點，分布在1 126個大豆磷酸化蛋白質上。在根瘤菌感染后的大豆根毛及脫落根中，有來自240個磷酸化蛋白質的273條磷酸化肽段含量發生顯著變化，數據揭示了大豆根毛磷酸化蛋白質組的獨特特征，描述了在根瘤菌感染反應中，激酶一底物和磷酸酶一底物相互作用所形成的復雜網絡。

3.2 非生物脅迫

與生物脅迫不同，非生物脅迫主要是指來自無機環境中的干擾因素，如干旱、炎熱、寒冷、營養不足、鹽分過多或者土壤中的有毒金屬等[31]。干旱、鹽分和溫度脅迫是影響自然界植物地理分布、限制農業植物生產力和威脅糧食安全的主要環境因素。理解植物對非生物脅迫的感知及適應機制，對于提高農業生產力、維護環境的可持續性至關重要。寒冷對水稻的生長發育影響很大，水稻幼苗在低溫條件下出現生長遲緩、葉面卷曲及部分葉片死亡等現象。為了研究水稻對低溫脅迫的抵御機制，Ji等[32]利用三氟乙酸/丙酮提取耐寒型水稻Fujisaka 5及寒冷敏感型水稻9311的全蛋白質，全蛋白質經二維凝膠電泳分離后進行MALDI-TOF/TOF質譜檢測，鑒定到59個抵御寒冷相關蛋白質并對其功能進行了分類。此外，研究者還發現在寒冷條件刺激下，膜組成成分及結構發生了破壞，代謝顯著改變，水稻防御體系激活。

干旱是植物生長抑制和作物減產的主要制約因素，全球氣候變化使得科學家對干旱問題的關注程度日益增加[33，34]。在干旱脅迫下，葉片氣孔閉合，二氧化碳的固定減少，導致通過卡爾文循環的NADP+再生減少。隨著光合系統活性和光合運輸能力的變化，更多的電子泄露并與氧氣反應，進而導致活性氧的產量增加[35]。活性氧水平過高將會引起脂質過氧化、蛋白質氧化以及酶活降低，核酸發生氧化損傷，最終引起細胞死亡。基于此，Tamburino等[36]以番茄葉綠體為研究對象，構建干旱模型及干旱一恢復模型，通過綜合利用熒光差異二維凝膠電泳技術與質譜技術，對葉綠體中參與干旱脅迫抵御過程的蛋白質進行了探究。試驗發現干旱脅迫條件下，番茄植物出現發育不良，脯氨酸、脫落酸水平升高，晚期胚胎基因轉錄水平升高。水分缺失對葉綠體蛋白質影響很大，主要影響能量相關蛋白質。

土壤重金屬污染是土壤無機物污染中危害較大的種類之一。重金屬污染來源有2種途徑，自然途徑及人為途徑。自然途徑主要是指成土母質及成土過程中對土壤重金屬含量的影響;人為因素則包括工業、交通、農業等帶來的重金屬污染。聚集在土壤中的重金屬由于無法被微生物分解而被植物吸收，進入植物體內，進而通過飲食進入人體。重金屬在人體內以有害濃度蓄積，威脅人類健康。研究重金屬脅迫下植物的蛋白質水平變化，對于農業生產及環境保護具有重要指導意義。舉例來說，鎘是一種非必需重金屬，高濃度的鎘會引發植物代謝活動紊亂，如呼吸和蒸騰抑制、碳水化合物代謝紊亂等，對植物的生長發育造成影響[37]。此外，鎘在人體內的蓄積會導致主要器官的慢性損傷[38]。針對鎘污染的嚴重后果，Xu等[39]利用含不同濃度CdCl2的培養液培養蘿卜幼苗，結合定量蛋白質組學方法、強陽離子交換法及實時定量PCR技術，對蘿卜根部組織全蛋白質進行了表達差異描述。對這些差異蛋白質的功能注釋顯示，它們主要參與碳水化合物和能量代謝過程、脅迫防御過程及信號傳導途徑。實時定量PCR結果很好地證實了蛋白質組數據的準確性和高可信度。同時，一些與碳水化合物代謝、活性氧清除、細胞轉運及信號傳導相關的候選靶標蛋白質也被鑒定出參與蘿卜鎘脅迫響應的調控，如乙酰輔酶A乙酰轉移酶、酰基輔酶A合成酶、草酰輔酶A脫羧酶和磷脂酶Dal等。Du等[40]利用不同濃度的PbCl2處理龍須菜，提取全蛋白質并進行二維凝膠電泳分離，將存在表達差異的蛋白質切下酶解后進行MALDI-TOF/TOF質譜檢測。質譜結果顯示，不同處理濃度下蛋白質的表達量變化幅度不同，其中有14個鉛脅迫相關蛋白質被檢測到，功能分析顯示其廣泛參與多種細胞功能，包括光合作用、能量和蛋白質代謝、碳水化合物運輸和代謝、信號傳導及抗氧化。超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽巰基轉移酶和熱休克蛋白70在鉛刺激下表達上調。對其他重金屬，如鋅[41]、汞[42]等也有詳盡的研究。

4 植物發育過程中的蛋白質組學分析

植物的發育伴隨著基因與蛋白質表達的改變，不同于基因組，蛋白質組可以實時地反映植物體發育不同階段的特點。對植物發育過程中蛋白質組的研究，可以更深入地了解植物生長發育的機制及其調控方式，對于農業、林業生產具有重要指導意義。Nambu等[43]對不同發育時間段接種的中慢生型百脈根根瘤菌全蛋白質進行了定量分析，以探究根瘤菌與宿主建立固氮共生關系過程中的代謝調節機制。研究者對537個節結成熟過程中的蛋白質表達量變化進行了質譜量化分析，發現碳和氨基酸代謝存在顯著變化。此外，中慢生型百脈根根瘤菌在節結形成初期進入缺氮生長狀態，而在中期進入富氮生長狀態，并在此階段吸收了氨。類似地，Marond-edze等[44]對不同發育階段的棗椰樹果實進行了蛋白質組學比較分析，深入描述了在水果成熟過程中的蛋白質豐度變化及發揮關鍵作用的蛋白質。

蓖麻作為一種重要的生物燃料作物，具有重要的應用價值。Shah等[45]對蓖麻植物的4個發育階段的全蛋白質進行了質譜分析，分別鑒定到了626、613 .449和356個蛋白質，共計882個非冗余蛋白質，并鑒定到2種蓖麻毒素亞型，表明蓖麻毒素的表達并不局限在種子中，可能發揮防御作用。

5 展望

近年來，隨著質譜技術的不斷發展，植物蛋白質組學的研究更為深入，尤其是經典的模式生物，如擬南芥、大豆、水稻等，從基因水平到蛋白質水平都得到詳盡的描述。然而，對于其他植物的蛋白質組學研究仍然停留在較低水平，如玉米、苜蓿、小麥等，雖然有相關文獻對其部分蛋白質組學特征進行報道，但仍然缺失對大部分蛋白質的有效鑒定。此外，植物蛋白質的翻譯后修飾，如乙酰化、磷酸化、糖基化、甲基化等在植物的生長發育及抵御脅迫的過程中發揮著重要作用，雖然已經建立起基于質譜技術的植物蛋白質翻譯后修飾研究方法，但依然缺少有效的分離、富集手段，以提高修飾蛋白質的定性和定量研究的效率及準確度。盡管如此，質譜技術仍然是植物蛋白質組學研究的有力工具，在后續研究中扮演不可或缺的角色。

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作者簡介：閆昕（1993-），女，河北保定人，在讀碩士研究生，研究方向為蛋白質組學，（電話）13752017761（電子信箱）664527679@qq.com。